COMUNICAÇÕES BREVES
Análise da diversidade do Plasmodium falciparum pela caracterização de clones isolados de amostras da região amazônica brasileira
Álvaro A. Couto; Marco A. Santos; Salma G. Oliveira
FSESP-MS Instituto Evandro Chagas Programa Malária Belém, Pará
Amostras de Plasmodium falciparum da região amazônica brasileira têm sido caracterizadas com base no estudo de marcadores genéticos.2,5
Esta investigações permitiram demonstrar a diversidade existente entre as amostras de áreas distintas, bem como de um mesmo paciente quando da ocorrência de casos de recrudescências.6 Desta forma, estes estudos comprovam que a população de parasitas isolados de um paciente é constituída de uma mistura de tipos geneticamente diferentes, coexistindo no mesmo paciente.
A clonagem, técnica inicialmente utilizada em malária de roedores10, agora tem sido aplicada nas investigações com P. falciparum1,9. Rosário4, com base na investigação de misturas de parasitas para tipos enzimáticos, isolou clones que exibiam um único tipo de cada enzima analisada. Trager et alii8 isolaram clones por micromanipulacão, analisando nestes a presença ou ausência de "knobs" nos eritrócitos infectados.
Todas as características estudadas no P. falciparum têm mostrado que os clones em crescimento in vitro permanecem estáveis por períodos consideráveis8.
No presente trabalho, descrevemos a análise de 8 clones isolados pelo método das diluições previamente descrito por Rosário4, utilizando-se para este estudo as amostras IEC-132/83 e IEC-145/83, obtidas de pacientes oriundos do Território Federal do Amapá e Tucuruí (PA), respectivamente. Após a coleta das amostras, estas foram submetidas a cultivo contínuo in vitro3, cuja metodologia tem permitido o uso experimental desses parasitas, sendo posteriormente caracterizadas com base no estudo de susceptibilidades a drogas e análise de tipos enzimáticos, onde se comprovou a existência de população mista para a enzima GPI-glucose-fosfato-isomerase (GPI-1 e GPI-2). Após esse estudo, as amostras foram criopreservadas em nitrogênio líquido.
A técnica de clonagem, em nosso programa, foi realizada com sucesso, primeiramente com a amostra IEC-132/83, em agosto de 1984 e, em seguida, com a amostra IEC-145/83, em fevereiro de 1985, tendo sido, portanto, a primeira vez que clones de P. falciparum foram isolados no Brasil. As duas amostras foram diluídas em meio RPMI 1640, estimando-se um parasita por 100 ul e posteriormente inoculadas em orifícios de microplacas. Após aproximadamente 21 dias, foram observados em microscppia óptica, e os inóculos positivos transferidos para placas de petri de 35 mm. Alguns destes clones foram caracterizados para dois marcadores genéticos, testes de sensibilidade às drogas e tipificação enzimática (tabela I).
Da amostra IEC-132/83 foram caracterizados três clones identificados (IEC-132/83-C,IEC-132/83-E e IEC-132/83-F) e da amostra IEC-145/83 foram caracterizados cinco clones (IEC-145/83-12, IEC-145/83-13, IEC-145/83-22, IEC-145/ 83-27 e IEC-145/83-30).
Tanto a amostra IEC-132/83 como a IEC-145/83, no que se refere aos tipos enzimáticos, apresentaram perfil idêntico, ou seja, todos os clones analisados foram do tipo GPI-2. Entretanto, observou-se que os clones apresentaram variações no nível de sensibilidade às drogas, uma vez que as amostras originais apresentavam-se resistentes à cloroquina, à amodiaquina e ao quinino e sensíveis à mefloquina. Os clones IEC-132/83-C, IEC-132/83-E e IEC-132/83-F apresentaram níveis de sensibilidade superiores e inferiores ao da amostra original. Para o quinino, apenas o clone IEC-132/83-C difere dos demais, apresentando nível de sensibilidade inferior ao do original.
Na amostra IEC-145/83 para a cloroquina não se verificaram variações, entretanto, para as demais drogas, observaram-se clones com até o dobro de resistência da amostra original.
Até o presente momento, não se tem determinado relação entre tipo enzimático e sensibilidade a drogas, porém futuras investigações com clones poderão determinar alguma possível relação entre essas características7.
Continuamos nossas investigações utilizando clones, objetivando determinar alguma possível relação entre tipo enzimático e sensibilidade a drogas.
Por outro lado, a produção de gemetócitos in vitro, a partir de clones, tem sido muito importante para obtenção de infecção experimental de mosquitos, principalmente por permitir estudos genéticos.
Finalmente, estas observações sugerem que a amostra original é formada por várias subpopulações e que estas caracterizadas isoladamente permitem a análise da composição genética das amostras de P. falciparum.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho contou com o apoio da FSESP CNPq FINEP SUCAM UNDP/WORLD BANK WHO. Agradecemos especialmente ao Dr. Virgílio E. do Rosário pela orientação técnica e aos laboratoristas José Maria Nascimento e Edvaldo Santa Rosa pelo auxílio nas técnicas laboratoriais de caracterização. Agradecemos, também, ao Dr. L. Shaw (Wellcome Parasitology FSESP I.E. CHAGAS) e Dra. Maria de Fátima Assis (UFPa Deptº Genética) pela revisão do manuscrito e à Sra. Margarete Garcia pela datilografia.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. BHASIN, V.K. & TRACER, W. Gametocyteforming and Non-gametocyte-forming Clones of Plasmodium falciparum. Am. J. Med. Hyg., 33 (4): 534-7, 1984.
2. COUTO, A.; ROSÁRIO, V.E. & WALLIKER, D. Análise enzimática de 56 amostras de Plasmodium falciparum da Bacia Amazônica (Brasil). R. bras. de Malariol. D. Trop., 35:11-9, 1983.
3. JENSEN, J.B. & TRAGER, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J Parasitol., 63, (5), 1977.
4. ROSÁRIO, V.E. Cloning of naturally ocurring mixed infections of malaria parasites. Science, 212:1037-8, 1981.
5. ROSÁRIO, V.E. Caracterização de cepas de Plasmodium falciparum do Brasil. R. Fund. SESP, 28 (2): 115-36, 1983.
6. ROSÁRIO, V.E.; COUTO, A.; SANTOS, M.A. & SOUZA, J.M. Caracterização de cepas de Plasmodium falciparum coletadas de pacientes recrudescentes. R, Inst. Med, Trop. São Paulo, 27 (5): 274-8, 1985.
7. THAITONG, S. Clone of different sensitivities in drug-resistent isolates of Plasmodium falciparum. Bull. WHO, 61 (4): 709-12,1983.
8. THAITONG, S.; BEALE, G.H.; FENTON, B.; Mc BRIDGE, J.; ROSÁRIO, V.; WALKER, A.; & WALLIKER, D. Clonal diversity in a single isolate of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Trans. Soc. of Trop. Med. Hyg., 78: 242-5,1984.
9. TRAGER, W.; TERSHAKOVEC, M.; LYANDVERT, L.; STANLEY, H.; LANNERS, N. & GUBERT, E. Clones of the malaria parasite Plasmodium falciparum obtained by microscope selection: Their characterization with regard to knobs, chloroquine sensitivity, and formation of gametocytes.
10. WALLIKER, D.; CARTER, R. & MORGAN, S. Genetics recombination in P. berghei. Parasitology, 66: 309-20, 1973. CULTURE, HEALTH AND ILLNESS: AN INTRODUCTION FOR HEALTH PROFESSIONALS.
Recebido para publicação em 17/05/86.