NOTA RESEARCH NOTE
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Érika C. Borges1 | Uso do Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) no estudo populacional do Triatoma brasiliensis Neiva, 1911 Use of Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) in the populational study of Triatoma brasiliensis Neiva, 1911
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| 1 Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas, Centro de Pesquisas René Rachou. Av. Augusto de Lima 1715, Belo Horizonte, MG 30190-002, Brasil. 2 Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz. Av. Augusto de Lima 1715, Belo Horizonte, MG 30190-002, Brasil. | Abstract We evaluated the genetic variability of Triatoma brasiliensis, the main vector of Chagas disease in Northeast Brazil, using specimens from three populations. Regions of genomic DNA were amplified by RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA), using two primers. The products were visualized after polyacrylamide gel electrophoresis followed by silver staining. A dendrogram constructed through the Dice similarity coefficient allowed for separation of the tested specimens into three distinct groups. The populations captured in areas from Ceará State showed similar profiles, but different from that captured in Piauí State. Our results indicate that RAPD can be used successfully in triatomine studies and suggest the presence of genetic variability between different populations of T. brasiliensis. Key words Chagas Disease; Triatominae; Insect Vectors; RAPD
Resumo Para o estudo de variabilidade genética em Triatoma brasiliensis, o principal vetor da doença de Chagas no Nordeste brasileiro, espécimes de três diferentes populações intradomiciliares foram analisados. Regiões do DNA genômico foram amplificadas utilizando dois iniciadores randômicos através da técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), visualizados em géis de poliacrilamida corados pela prata. Os perfis originados se mostraram bastante homogêneos quando comparados intrapopulacionalmente. Populações capturadas em duas regiões diferentes do Estado do Ceará também apresentaram homogeneidade entre si, mas, quando comparadas com a população proveniente do Piauí, foi possível diferenciá-las. Esses resultados, preliminares, indicam que o RAPD pode ser usado com sucesso nos estudos de variabilidade em triatomíneos, bem como sugerem a existência de variabilidade entre diferentes populações de T. brasiliensis pertencentes a uma mesma subespécie. |
Introdução
A doença de Chagas ou tripanosomíase americana é um importante problema de saúde pública que atinge principalmente os países das Américas Central e do Sul. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (1991), 28% das pessoas infectadas pelo Trypanosoma cruzi estão no Brasil. De acordo com Dias (1979) a transmissão vetorial é a principal responsável pela manutenção da endemia, estando a distribuição da doença humana intimamente relacionada com a presença de triatomíneos domiciliados na área endêmica. No Nordeste brasileiro, o Triatoma brasiliensis é o principal vetor da doença, ocupando tanto tocas de roedores e locas de pedras nos ambientes silvestres (Alencar, 1987) como os ambientes artificiais. Em ambos os ambientes, eles se apresentam em altas densidades populacionais, o que torna seu controle mais difícil (Dias & Diotaiuti, 1998).
Estudos biológicos, morfológicos e epidemiológicos já foram feitos com essa espécie, mas pouco se conhece a respeito de sua estrutura populacional. Costa et al. (1997a, 1997b) utilizaram marcadores biológicos, bioquímicos e morfológicos para o estudo de diferentes populações de T. brasiliensis e observaram a existência de diferenças marcantes entre elas, estando estas relacionadas aos padrões de coloração, utilizados como marcadores na classificação das diferentes subespécies. Nos últimos tempos, tem sido utilizados inúmeros indicadores de variabilidade populacional em triatomíneos. Esses indicadores fornecem uma grande quantidade de informações importantes para os estudos de biossistemática, genética populacional e evolução dos triatomíneos. Este trabalho propõe investigar a presença de variabilidade genética entre diferentes populações de T. brasiliensis utilizando a técnica de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Em 1990, essa técnica foi descrita simultaneamente por Williams et al. (1990) e Welsh & McCleland. (1990). Baseia-se na amplificação de seqüências de DNA randômicas utilizando iniciadores pequenos de seqüências arbitrárias, que detectam polimorfismos, mesmo na ausência de informações da seqüência específica de nucleotídeos do DNA alvo. Os marcadores de RAPD são extremamente apropriados para realização de mapas genéticos, diferenciação de espécies animais e vegetais e para impressões de DNA, com especial utilidade nos estudos de genética de populações.
Harry et al. (1998) fizeram uma revisão sobre a utilização do RAPD na entomologia e sugerem que esses marcadores são úteis em estudos de genética populacional e podem auxiliar nos programas de controle através da localização de genes ou de regiões importantes do genoma. Em triatomíneos, poucos estudos foram feitos utilizando essa técnica. Carlier et al. (1996) apresentaram, em um workshop, dados preliminares sobre o uso do RAPD na comparação de espécies e no estudo de variações intra-específicas em triatomíneos. Os resultados encontrados proporcionaram uma fácil separação entre Triatoma infestans e T. sordida e entre populações silvestres e domiciliares de T. infestans. Garcia et al. (1998) estudaram diferentes espécies de triatomíneos e conseguiram distinguir diferentes espécies de Rhodnius e os principais gêneros da subfamília.
Materiais e métodos
Foram utilizadas três diferentes populações de T. brasiliensis capturadas no intradomicílio dos municípios de Independência e Novo Oriente, ambos no Ceará, e de Simplício Mendes, no Piauí. De cada inseto adulto (dez machos e dez fêmeas) foram retiradas as patas, que foram estocadas em freezer, à temperatura de -70oC, para posterior extração de DNA. O protocolo de amplificação foi previamente usado em estudos de Schistosoma mansoni e Trypanosoma cruzi (Dias Neto et al., 1993; Steindel et al., 1993). Amostras de DNA de cada indivíduo foram amplificadas, usando cerca de 4ng de DNA molde. Os iniciadores 3302 (5'-GGGTAACGCCC-3') e 3304 (5'-GCACTGTCA-3') foram selecionados dentro de um conjunto de nove iniciadores testados. Foram construídas matrizes com base na presença ou ausência de bandas, utilizadas para obtenção do coeficiente de similaridade de Dice (1945) e construção de um dendrograma pelo programa NTSYSpc 2.0 (Rohlf, 1998).
Resultados e discussão
Foram analisados os perfis eletroforéticos de vinte insetos (dez machos e dez fêmeas) de cada uma das populações. A partir dos perfis originados por cada iniciador, pode-se observar uma grande homogeneidade intrapopulacional. Para a análise de compartilhamento de bandas, foram usadas 94 bandas, geradas pelos dois iniciadores. A partir daí, foi calculada uma matriz de similaridade e construído o dendrograma (Figura 1). O dendrograma obtido mostra, claramente, três grupos distintos, sendo um grupo formado pelas populações do Ceará e o outro, pela população do Piauí. É importante ressaltar que tanto as populações de T. brasiliensis encontradas no Ceará quanto as encontradas no Piauí, segundo Costa (1997), são pertencentes a uma mesma subespécie, tendo, portanto, características biológicas e morfológicas muito semelhantes. Entretanto, a técnica utilizada foi sensível o suficiente para detectar variações entre essas populações, podendo ser usada com sucesso em estudos de variabilidade populacional em triatomíneos. Estudos com a utilização de outros iniciadores, outras populações e outras técnicas estão sendo realizados, mas esses resultados preliminares sugerem a existência de heterogeneidade populacional em T. brasiliensis.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Fundação Nacional de Saúde dos Estados do Ceará e Piauí pelo auxílio nas capturas dos triatomíneos.
Referências
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