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Introdução

Historicamente, a anemia falciforme, expressão clínica dos homozigotos do gene da hemoglobina S e a forma mais conhecida das hemoglobinopatias, tem sido associada com alta morbidade e mortalidade na infância, devido a sepse bacteriana, crise de seqüestração esplênica e síndrome torácica aguda (Shaffer et al., 1996). O tratamento médico de suporte pode reduzir esses índices (Embury, 1995). Em 1986, um estudo clínico randomizado duplo-cego, demonstrou que o uso profilático de penicilina, reduz a morbidade e mortalidade de infecções bacterianas em crianças abaixo de cinco anos (Gaston et al., 1986). Frente a esses dados, que sugerem a melhora da sobrevida com o acompanhamento médico e educacional, surgiram vários estudos mostrando a necessidade do diagnóstico precoce, podendo ser realizado mesmo no período neonatal (Diaz-Barrios, 1989; Garrick et al., 1973; Gill et al., 1989).

Apesar da incidência de anemia falciforme ser mais comum em pessoas da raça negra, estudos populacionais têm demonstrado a presença de hemoglobina S em pessoas descendentes de populações do Mediterrâneo, Caribe, América Central e do Sul, Arábia e Índia. O Brasil apresenta uma população com diferentes origens raciais e com diversificados graus de miscigenação (Azevedo, 1980); assim, para um programa ser eficiente, todos os recém nascidos deveriam ser testados independentemente do grupo étnico (Angastiniotis & Modell, 1998).

O maior estudo de prevalência e distribuição de hemoglobinopatias realizado no Brasil, analisou amostras de 55.217 indivíduos, em quarenta cidades, com idades entre um mês e noventa anos, provenientes de centros de saúde, escolas e bancos de sangue. Neste estudo, 3,08% dos indivíduos tinham hemoglobinas anormais desdobradas em variantes moleculares (2,49%), talassemias (0,53%) e alterações induzidas pela formação de meta-hemoglobinemias (0,06%). A condição HbAS foi a mais prevalente, com 1.038 casos (60,95%) do total de 1.703 portadores; as talassemias alfa e beta somaram 265 casos (15,56%); a condição HbAC foi detectada em 243 (14,27%) e as formas mais raras, em 156 casos (9,27%). A freqüência de HbSS na população total foi de 0,04%. Entre os vinte portadores com HbSS identificados e comprovados clinicamente, 18 pertenciam ao grupo negróide (0,22%) e dois ao grupo caucasóide (Naoum et al., 1987).

Alguns estudos procuraram estimar a prevalência de hemoglobinopatias no Sul do Brasil. Pedrollo et al. (1990), estudaram 559 amostras de sangue do cordão umbilical e determinaram uma freqüência de 3,7% de Hb Bart's (alfa-talassemia) na população geral (5,4% em negros e 2,5% em brancos). Salzano et al. (1968), através de exames realizados na rotina de um laboratório público de Porto Alegre, encontraram uma freqüência de HbAS de 6.8%, HbAC de 1%, HbSC de 0,1% e HbSS de 0,1%, em uma população negróide formada em sua maioria por adultos. Entretanto, considerando apenas as crianças menores de nove anos, a doença falciforme foi encontrada em 3,5% dos indivíduos (Salzano & Tondo, 1962; Salzano et al., 1968). A freqüência de heterozigotos para beta-talassemia foi estimada em 1,1%, conforme o estudo realizado em 704 caucasianos adultos (Freitas & Rocha, 1983).

Entretanto, não se conhece a freqüência das hemoglobinopatias em recém-nascidos nesta região, o que permitiria a identificação real da prevalência antes da ocorrência de manifestações clínicas em uma amostra não selecionada.

O objetivo deste estudo, é estabelecer a prevalência das hemoglobinopatias nos recém-nascidos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), que já participam do Programa de Triagem Neonatal para hipotireoidismo congênito e fenilcetonúria, independente da raça ou ascendência, e avaliar o benefício da adição da triagem para hemoglobinopatias ao programa em curso.

Metodologia

Foram analisados, 1.615 amostras consecutivas dos neonatos que participaram da coleta do "Teste do Pezinho - Triagem Neonatal de Distúrbios Metabólicos", realizada no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), durante o período de 18 de março a 30 de outubro de 1999. As variáveis avaliadas durante a coleta foram: data de nascimento, data da coleta, data da realização da eletroforese, sexo, cidade e endereço da residência materna e peso de nascimento. Os pais foram classificados em brancos, negros, mistos, indígenas e orientais levando em consideração a cor da pele e olhos, espessura dos lábios e características do cabelo (Azevedo, 1980; Sousa, 1982).

Durante o período do estudo, o número de nascimentos no HCPA, foi de 3.024 nativivos. Assim, aproximadamente 55% dos nascidos no hospital, realizaram o Teste de Triagem Neonatal para Distúrbios Metabólicos.

A técnica utilizada para a pesquisa de hemoglobinopatias como triagem neonatal, foi a eletroforese de hemoglobina por focalização isoelétrica em gel de agarose (WALLAC-ISOLAB Akron/Estados Unidos), com amostras de sangue total coletadas em papel filtro, a partir de punção do calcanhar, armazenadas e refrigeradas a uma temperatura de 8^oC.

Os casos classificados como alterados, foram os que apresentaram banda S ou C, banda na posição da HbA₂ pela proximidade com a HbC ou outra banda que não HbA ou HbF.

A confirmação diagnóstica dos casos alterados na focalização isoelétrica, foi realizada por meio das eletroforeses das hemoglobinas em acetato de celulose com pH 8,6 e em citrato de ágar com pH 6,2 do recém-nascido e dos pais. A análise dos pais, foi realizada com o intuito de identificar os pacientes com risco de serem homozigotos antes da normalização da concentração da Hb Fetal, que ocorre após o sexto mês de vida.

Por definição, os pacientes heterozigotos para determinada variante, devem apresentar concentração da hemoglobina alterada inferior a 45%, geralmente variando entre 30 a 40%, e predomínio da HbA (Naoum & Domingos, 1997; Serjeant, 1999), enquanto que os pacientes homozigotos para as variantes HbS e HbC, apresentam concentrações superiores à 90% e ausência de HbA.

Análise estatística

Foram utilizadas estatísticas descritivas para a comparação entre as variáveis, e utilizados o teste do Qui-quadrado, o teste exato de Fisher ou o teste "t" com alfa crítico £ 0,05. Os dados foram armazenados em planilha do programa Microsoft Excel 7.0 para Windows 98, transferidos para banco de dados dBase e posteriormente analisados no programa SPSS 8.0 (SPSS Incorporation, 1997).

Considerações éticas

Os benefícios da identificação neonatal em termos de reduzir a morbidade e a mortalidade de crianças portadoras de hemoglobinopatias, claramente superam os riscos da triagem. O procedimento de coleta por punção de calcâneo é considerado seguro e pouco doloroso, e inclui pesquisa de outras doenças genéticas já consagradas. Considerando que, o delineamento deste estudo utilizou o material coletado para o Teste de Triagem de Distúrbios Metabólicos, tomou-se por base a resolução normativa 02/97, da Comissão de Pesquisa e Ética em Saúde do Grupo de Pesquisa e Pós-Graduação do HCPA, que regulamenta a Utilização de Material Biológico Descartado em Projeto de Pesquisa. Assim, na necessidade de informar o resultado anormal e possibilitar o encaminhamento precoce deste paciente, foi utilizado o Termo de Compromisso para a Utilização de Dados (Resolução 1/97), a fim de garantir a privacidade dos dados coletados conforme as disposições "c" e "d" dessa resolução (Goldin, 1997), e aceita pelo Comitê de Ética do hospital.

Resultados

Durante o período do estudo, foram coletadas 1.616 amostras, tendo ocorrido uma perda, sendo a eletroforese por focalização isoelétrica realizada em 1.615 recém-nascidos. Ao total, 98,8% dos indivíduos estudados moravam em Porto Alegre ou na área metropolitana, sendo 48,8% do sexo feminino e 50,2% do sexo masculino. O peso médio de nascimento foi de 3.175g (DP ± 616g), com variação de 630g a 4.950g.

A distribuição das raças dos pais, dado disponível em 208 casos, avaliada durante o primeiro mês do estudo, foi a seguinte: entre os pais 66,2% de brancos, 23,2% de negros e 10,6% de mistos; entre as mães 69,2% de brancas, 22,6% de negras e 8,2% de mistas. Não foram encontrados índios ou orientais na amostra estudada.

O tempo médio decorrente entre o nascimento e a coleta do teste de triagem, foi de 11,7 dias (DP ± 11,1 dias) com faixa de variação de 3 a 116 dias. A eletroforese foi realizada, em média, 22 dias após a coleta com desvio padrão de dez dias.

A Tabela 1 resume as características da população estudada.

Das 1.615 amostras, 39 foram classificadas como alteradas. Duas outras foram acrescidas a estas, pois, apesar de normais, eram nascimentos gemelares de pacientes com alteração. Assim, 41 crianças foram chamadas para repetir a eletroforese em acetato de celulose e em citrato de ágar.

Todos esses recém-nascidos, foram procedentes da região metropolitana e da cidade de Porto Alegre. Em comparação com a amostra total, não existiram diferenças entre a distribuição do sexo, peso de nascimento e tempo entre o nascimento e a coleta e a realização da eletroforese por focalização isoelétrica (Tabela 2). Entretanto, a distribuição da raça dos pais, apresentou um número maior de indivíduos negros e mistos (p < 0.05).

A média de idade em que os indivíduos com triagem alterada realizaram eletroforese para confirmação diagnóstica, foi de 98,7 dias (DP ± 31,5) variando entre 47 a 152 dias. Entre a coleta da triagem até a reconsulta, foram 57,1 dias (DP ± 23,6) e entre a focalização isoelétrica até a reconsulta, foram 33,3 dias (DP ± 20,1). Os pacientes chegaram à reconsulta com 75,3 (DP ± 30) dias de vida.

A eletroforese por focalização isoelétrica identificou a presença da hemoglobina S em vinte amostras, e da hemoglobina C em seis (Tabela 3). No total de 1615 amostras estudadas, esses valores correspondem a uma freqüência de 1,2% de portadores do gene da anemia falciforme e 0,4% de portadores do gene da doença de hemoglobina C. Assim, para cada 62 neonatos triados no HCPA, um foi portador do gene para hemoglobinopatia S ou C, independente da raça ou ascendência.

Em todas as amostras que apresentaram HbS ou HbC e que foram realizadas a eletroforese em gel de citrato/ágar, houve concordância dos resultados e a identificação do progenitor portador. Oito neonatos não retornaram para a reconsulta, desses, três (1 AS e 2 AC) são heterozigotos, já que a focalização isoelétrica identificou HbA em concentração superior a 20%. Entretanto, nos outros cinco casos não é possível determinar o fenótipo.

As outras alterações encontradas na triagem neonatal foram: duas amostras com HbBarts em concentração inferior a 2%; uma amostra com HbF variante, esta foi confirmada por biologia molecular como variante da cadeia gama, porém não retornou para reconsulta; uma banda desconhecida com migração próxima a HbS que não ocorreu na eletroforese em celulose/ágar, assim como os pais foram normais e nove pela presença de HbA₂. Entre os neonatos que apresentaram HbA_2, sete retornaram para reconsulta, sendo que em todos, a eletroforese em celulose/ágar foi normal, assim como em seus pais. Dessas crianças, quatro tinham recebido transfusões sangüíneas previamente à coleta: duas por incompatibilidade Rh, uma por prematuridade e outra por hiperbilirribinemia neonatal severa; em uma, a amostra foi coletada com 50 dias de vida e em outras duas, com 14 e 12 dias de vida. Apenas um recém-nascido, chamado por apresentar Hb Barts, retornou para consulta e seus exames foram normais.

Discussão

O principal objetivo deste estudo, foi determinar a freqüência das hemoglobinopatias entre os recém-nascidos que se submeteram à Triagem Neonatal para Distúrbios Metabólicos. O fato de que apenas em 55% dos nascidos no HCPA, durante o período da análise tenham coletado o teste, é o principal argumento de vários autores para a realização da triagem de hemoglobinopatias em coleta de cordão umbilical (Bandeira et al., 1999; Lobel et al., 1989; Mack, 1989; Pantaleão et al., 1993). Entretanto, o diagnóstico dos distúrbios metabólicos, principalmente a fenilcetonúria, não é possível no momento do parto, o que tornaria necessária a realização de duas coletas em momentos diferentes, para completar os exames de triagem neonatal. A experiência em outros estudos, mostra que a educação e a orientação sobre as vantagens dos exames para pais e profissionais de saúde, aumentam a procura pelos testes de triagem (Compri et al., 1996; Filho et al., 1988; Grover, 1989; Shafer et al., 1996).

Entre os 41 indivíduos com resultados alterados, 13 não retornaram para consulta. Desses, oito não buscaram o resultado da triagem conforme a rotina do hospital. Os demais, mesmo sendo informados do resultado, não retornaram. Esses indivíduos não foram localizados nos endereços que forneceram. Todos os pacientes que consultaram e que foram orientados após receber os resultados, retornaram para a realização dos exames confirmatórios, não havendo nenhuma recusa. Novamente, a educação e orientação parece ser fundamental para o sucesso da triagem neonatal (Rowley, 1989).

Historicamente, a anemia falciforme e a doença da hemoglobina C têm origem na África, onde persistem as maiores prevalências. A sua presença nas Américas é decorrente da imigração dos indivíduos pertencentes à raça negra, originários desse continente (Flint et al., 1993). Neste estudo, a variável cor foi avaliada de forma subjetiva, considerando cor da pele e características faciais e do cabelo. De fato, apenas os pacientes que consultaram por apresentar resultados alterados, e um pequeno grupo da população geral em que foi possível avaliar esta informação na presença dos pais, foram classificados. Esta análise, demonstra um número maior de negros e mistos, equivalente a pardos e pretos, em relação à Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios de 1996 (IBGE, 1996), onde a distribuição da população por cor na área metropolitana de Porto Alegre é de 86,05% de brancos, 5,75% de pretos e 7,72% de pardos. Essa diferença, pode ter ocorrido devido à uma possível seleção da população que consulta no HCPA, onde predomina o atendimento pelo Sistema Único de Saúde de indivíduos sócio-economicamente menos favorecidos, classe em que o número de pretos e pardos é maior.

A miscigenação da nossa população é significativa e progressiva, e a classificação por cor da pele e outras características, não pode ser atualmente utilizada como única mensuração de raça (Pantaleão et al., 1993; Salzano et al., 1968) Entretanto, o fenótipo das hemoglobinopatias S ou C, permite afirmar que existe ascendência africana. Neste estudo, apenas o grupo de pais dos casos AS e AC, demonstraram diferença estatística entre a variável cor, com predomínio de indivíduos classificados como mistos. Este dado, confere com a presença de um número maior de pais AS (Tabela 3). Entre os casais avaliados, apenas seis casais eram concordantes na raça negra, cinco casais eram brancos e mistos, três brancos e negros, dois concordantes em mistos, um misto e negro e três casais classificados como brancos geraram filhos heterozigotos para hemoglobinopatia S ou C. Esta é a característica que demonstra a dinâmica que o gene apresenta na população, tornando a herança não exclusiva da raça negra e justificando a triagem universal. Assim, podemos dizer que 1,6% da população estudada herdou um gene originário do continente africano.

As amostras de sangue coletadas em papel filtro, permitem a associação da triagem para hemoglobinopatias com os demais testes, têm fácil transporte e armazenamento, ainda que diminuam a estabilidade das hemoglobinas (Papadea et al., 1994). Desde 1973, quando Garrick et al. (1973) descreveram o método de hemolisado para a eluição da hemoglobina do papel filtro e a possibilidade de realizar a eletroforese em acetato de celulose e citrato de ágar para a triagem neonatal, vários grupos consideram este método adequado para a coleta e armazenamento dos testes de neonatais (Githens et al., 1990; Grover et al., 1983; Schedlbauer & Pass, 1989; Shafer et al., 1996). Kinney et al. (1989) compararam amostras de sangue de cordão, simultaneamente coletadas em papel filtro e em tubos com heparina com até 15 dias, e demonstraram que é possível identificar claramente as bandas de HbF, HbA, HbS e HbC nos dois métodos, embora a resolução fosse melhor nas amostras dos tubos. A introdução das técnicas com maior sensibilidade, como a eletroforese por focalização isoelétrica e a cromatografia líquida de alta resolução, além de possibilitarem a extração de DNA para a análise genotípica, consolidaram a coleta em papel filtro (Huisman, 1989; Kleman et al., 1989; Kutlar et al., 1990; Papadea et al., 1994; Wajcman et al., 1993).

Neste estudo, só foram utilizadas amostras de sangue em papel filtro, coletadas rotineiramente para a Triagem de Distúrbios Metabólicos do HCPA. Em todos os casos, houve quantidade suficiente para a realização da eletroforese, possibilitando a visualização adequada da HbF, HbA e de outras variantes. O armazenamento, em geladeira a 4-8^o C, e o transporte ao laboratório, onde foram realizados os testes, foram simplificados pela coleta em papel filtro, tendo apenas uma amostra sido perdida após a identificação.

A eletroforese por focalização isoelétrica, é considerada um método conveniente para detectar variantes da hemoglobina, mesmo quando em concentrações baixas como ocorre no período neonatal, além de possibilitar a distinção entre homozigotos e heterozigotos (Beuzard et al., 1981; Dubart et al., 1980). Quando comparado com a eletroforese em acetato de celulose, ela se mostrou superior, pois além da melhor resolução, possibilita a separação de HbS da HbF de forma mais evidente (Kleman et al., 1989). Em termos de custo, apesar do equipamento para análise por a focalização isoelétrica ser mais caro, os reagentes têm preço equivalente e é possível realizar 72 testes a cada seis horas.

Neste estudo, todas as amostras foram triadas pela focalização isoelétrica, tendo como método de confirmação a eletroforese em acetato de celulose e em citrato de ágar em novas amostras. Esse método, permitiu a identificação de 26 portadores do gene da HbS e HbC, sendo que houve concordância em todas as amostras em que foi possível a recoleta.

Segundo um estudo realizado por Pedrollo et al. (1990), a freqüência de Hb Barts (alfa-talassemia) na população geral de Porto Alegre, é de 3,7% (5,4% em negros e 2,5% em brancos). Entretanto, das 1.615 amostras que analisamos, apenas em duas se identificou a presença de HbBarts (0,12%). Essa freqüência, muito inferior à encontrada previamente, provavelmente se deve à técnica utilizada.

A falha em detectar bandas rápidas, característica da HbBarts, já foi documentada como conseqüência do armazenamento em papel filtro. Neste meio, as hemoglobinas perdem sua estabilidade devido à oxidação do ferro da fração heme e à ação de resíduos de glutamina e asparagina na molécula protéica. Este efeito é progressivo em relação ao tempo da coleta até a realização da eletroforese (Kinney et al., 1989; Kutlar et al., 1990). A média de tempo entre a coleta e a realização da eletroforese por focalização isoelétrica, foi de 22 dias neste estudo e esse período certamente colaborou para a baixa sensibilidade em detectar a HbBarts. Entretanto, até o momento, não existem evidências que sugiram que a identificação precoce da a-talassemia tenha impacto na saúde dos recém-nascidos (Kinney et al., 1989).

Salzano et al. (1968), através de exames realizados na rotina de um laboratório público de Porto Alegre, encontraram uma freqüência de HbAS de 6.8%, HbAC de 1%, HbSC de 0,1% e HbSS de 0,1% em uma população negróide formada em sua maioria por adultos. Entretanto, considerando apenas as crianças menores de nove anos, o traço falciforme foi encontrado em 3,5% dos indivíduos (Salzano et al., 1968; Tondo e Salzano, 1962). A freqüência encontrada neste estudo para portadores do gene da Doença Falciforme, foi de 1,2% e para portadores do gene da Doença da Hemoglobina C, foi de 0,4%. Assim, 1,6% da amostra estudada, apresentou uma variante da hemoglobina que pode acarretar uma doença em que a intervenção precoce reduz suas conseqüências.

Esses dados sugerem que a inclusão da triagem neonatal para hemoglobinopatias nos projetos já implementados para fenilcetonúria e hipotireoidismo congênito, apresenta muitas vantagens e deve ser considerado pelos programas de saúde.

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Recebido em 13 de maio de 2000
Versão final reapresentada em 12 de novembro de 2001
Aprovado em 25 de janeiro de 2002