Resumos

Introdução

Infecções pelo papilomavírus humano (HPV) são consideradas como a doença sexualmente transmitida mais comum, representando 450 milhões de pessoas infectadas na região anogenital, com incidência de 1% e prevalência superior a 50% no mundo ¹1 . Foldvari M. HPV infections: can they be eradicates using nanotechnology? Nanomedicine 2012; 8:131-5..

O HPV é universalmente aceito como agente causal do câncer de colo uterino e, em anos recentes, vem se especulando sua relação com o câncer de cavidade oral e orofaringe. O HPV 16 é o tipo mais comum associado ao câncer oral e ao de colo de útero, enquanto os tipos 6 e 11 são mais frequentes em lesões benignas e pré-malignas e raramente nas lesões neoplásicas da cabeça e do pescoço. Os achados comuns dos mesmos tipos de HPV (6, 11, 16 e 18) em mucosa oral e genital são um forte indicativo para a transmissão orogenital ²2 . Xavier SD, Bussoloti Filho I, Carvalho JM, Framil VMS, Castro TMPG. Frequência de aparecimento de papilomavírus humano (HPV) na mucosa oral de homens com HPV anogenital confirmado por biologia molecular. Arq Int Otorrinolaringol 2007; 1:36-44.^,33 . Lo Muzio L, Campisi G, Giovannelli L, Ammatuna P, Greco I, Staibano S, et al. HPV DNA and survivin expression in epitelial oral carcinogenesis: a relationship? Oral Oncol 2004; 40:736-41.^,44 . Oliveira MC, Soares RC, Pinto LP, Costa LL. HPV e carcinogênese oral: revisão bibliográfica. Rev Bras Otorrinolaringol 2003; 4:553-9..

Muitos estudos comprovam a associação do HPV com o câncer cervical. Outros foram publicados relacionando a presença de HPV no câncer oral. No Brasil e principalmente na Região Norte, esses estudos são escassos, assim este estudo se propõe a verificar a prevalência do HPV e os tipos mais prevalentes de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58 em indivíduos sem lesões clinicamente diagnosticáveis na cavidade oral, pois a realização de testes capazes de identificar o HPV pode ser um importante método para o diagnóstico precoce de lesões neoplásicas na cavidade oral e orofaringe.

Método

Este estudo caracteriza-se como transversal analítico. A amostra foi composta de raspado bucal de 166 indivíduos que procuraram atendimento na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Pará, selecionados aleatoriamente, considerando o volume de atendimentos em um semestre. Os critérios de inclusão dos participantes foram não apresentar lesões clinicamente diagnosticáveis na cavidade bucal, residirem em Belém, Pará, e concordarem em participar da pesquisa após serem devidamente esclarecidos de seus objetivos. Considerando ser um estudo observacional e não necessitar da consideração do poder do teste, foram adotados grau de confiança de 99% e erro amostral absoluto de 10% para calcular o tamanho amostral. Como não existiam estudos prévios semelhantes no estado, considerou-se prevalência estimada de 50% para efeito do cálculo do tamanho amostral.

A análise laboratorial para identificação viral foi realizada pela técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase). Para a obtenção de DNA, foi coletado material em raspado com escova estéril (kit para coleta de colpocitologia oncótica) da mucosa do vestíbulo bucal bilateralmente, superfície dorsal e ventral de língua, palato duro, palato mole e assoalho bucal. O DNA foi extraído utilizando-se o kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos).

Para a pesquisa de HPV, foram utilizados dois procedimentos de PCR: um para detecção do DNA viral e outro para tipagem. As amostras positivas para HPV foram tipadas para os vírus tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58.

PCR 1: realizada em termociclador Eppendorf (Hamburgo, Alemanha), utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Madison, Estados Unidos). Para cada reação, foram utilizados 10µL de Mix, 8,2 de água e 0,8µL de oligos MY9 e MY11 e 1,0µL de DNA. A reação foi padronizada com um ciclo de desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos e 40 ciclos da amplificação de PCR, com desnaturação em 94ºC por 30 segundos, anelamento a 56ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. Extensão final ocorreu a 72ºC por 5 minutos com reação mantida a 10ºC. As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em TBE.

PCR 2: PCR em tempo real no StepOnePlus da Applied Biosystems (Foster, Estados Unidos), utilizando sondas específicas e kit Platinum qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). A reação consistiu de 40 ciclos de desnaturação a 95ºC por 30 segundos e anelamento e extensão a 60ºC.

Para controle da presença de DNA, as amostras foram submetidas à PCR para β globina, nas mesmas condições usadas para HPV. Todas as reações foram realizadas utilizando-se um controle positivo de câncer de colo uterino e um controle negativo de amostra sabidamente negativa para PCR 1 e dois controles negativos, na PCR 2, para estabelecer confiabilidade à reação.

Este projeto foi aprovado em Comitê de Ética em Pesquisa, de acordo com as normas vigentes.

Resultados

Em relação à faixa etária, 43,4% (n = 72) tinham de 18 a 29 anos de idade; 37,4% (n = 62), de 30 a 49 anos; 12,0% (n = 20), de 50 a 59 anos; e 7,2% (n = 12), de 60 a 79 anos. A idade média foi de 35,9; e a mediana, de 33 anos.

Quanto ao sexo, 62,0% (n = 103) pertenciam ao feminino; e 38% (n = 63), ao masculino. Quando observada a cor da pele, 75,3% (n = 125) eram pardos; 13,3% (n = 22), negros; e 11,4% (n = 19), brancos. Tabagismo foi relatado por 6,6% da amostra; e o álcool, por 23,5%.

A prevalência de indivíduos infectados pelo HPV foi de 24,1% (n = 40) (Tabela 1).

As amostras infectadas pelo HPV foram submetidas à PCR para tipagem dos tipos 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58, e observou-se a presença do HPV 6 em 7,5% (n = 3); HPV 18, em 12,5% (n = 5); e HPV 58, em 2,5% (n = 1) (Tabela 2).

Os HPVs 11, 16, 31, 33, 35 e 52 não foram encontrados em nenhuma das amostras investigadas, totalizando 31 amostras positivas para HPV sem a presença dos tipos analisados (Tabela 2).

Não foi observada associação entre infecção pelo HPV e idade (p = 0,24) e sexo (p = 0,57). A associação entre infecção por HPV e cor da pele foi estatisticamente significante (p = 0,03). Houve uma maior proporção de negros (13,3%, n = 22) no grupo de não infectados (16,7%, n = 21) que no de infectados (2,5%, n = 1).

Discussão

O perfil da amostra corresponde às características da população paraense e dos pacientes que procuram atendimento odontológico. Mulheres procuram mais serviços de saúde por terem mais preocupação com seu bem-estar e estética que os homens e estarem vinculadas a tipos de ocupação com horários menos rígidos que os homens na sua maioria ⁵5 . Carvalho G, Rosemburg CP, Buralli KO. Avaliação de ações e serviços de saúde. Mundo Saúde 2000; 1:72-88.. A cor da pele predominante no estado é parda, explicando a prevalência de 75,3%.

Estudos envolvendo detecção de HPV na mucosa oral normal divergem na prevalência. Esquenazi et al. ⁶6 . Esquenazi D, Bussoloti Filho I, Carvalho MGC, Barros FS. A frequência do HPV na mucosa oral normal de indivíduos sadios por meio da PCR. Braz J Otorhinolaryngol 2010; 1:78-84. verificaram ausência de HPV nos 100 voluntários universitários pesquisados no Rio de Janeiro. Baixas prevalências foram encontradas por Ammatuna et al. ⁷7 . Ammatuna P, Campisi G, Giovannelli G, Giambelluca D, Alaimo C, Mancuso S, et al. Presence of Epstein-Barr virus, cytomegalovirus and human papillomavirus in normal oral mucosa of HIV-infected and renal transplant patients. Oral Dis 2001; 7:34-40. (3,3%) e Migaldi et al. ⁸8 . Migaldi M, Pecorari M, Forbicini G, Nanni N, Grottola A, Grandi T, et al. Low prevalence of human papillomavirus infection in the healthy oral mucosa of a Northern Italian population. J Oral Pathol Med 2012; 41:16-20. na Itália (1,2%). Altas prevalências foram observadas por Zhang et al. ⁹9 . Zhang ZY, Sdek P, Cao J, Chen WT. Human papillomavirus type 16 and 18 DNA in oral squamous cell carcinoma and normal mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg 2004; 1:71-4. na China (55%) e Kristoffersen et al. ¹⁰10 . Kristoffersen AK, Enersen M, Kverndokk E, Sunde PT, Landin M, Solheim T, et al. Human papillomavirus subtypes in oral lesions compared to healthy oral mucosa. J Clin Virol 2012; 53:364-6. na Noruega (56%).

A prevalência detectada nesse estudo (24,1%) foi similar à de Llamas-Martinez et al. ¹¹11 . Llamas-Martínez S, Esparza-Gómez G, Campo-Trapero J, Cancela-Rodríguez P, Bascones-Martínez A, Moreno-López LA, et al. Genotypic determination by PCR-RFLP of human papillomavirus in normal oral mucosa, oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples in Madrid (Spain). Anticancer Res 2008; 28:3733-42. na Espanha, 23,3%. O HPV 16 não foi detectado, corroborando com os dados aqui encontrados.

Kristoffersen et al. ¹⁰10 . Kristoffersen AK, Enersen M, Kverndokk E, Sunde PT, Landin M, Solheim T, et al. Human papillomavirus subtypes in oral lesions compared to healthy oral mucosa. J Clin Virol 2012; 53:364-6. verificaram presença de HPV 6, 11 e 16. HPV 6 e 11 foram encontrados em duas amostras concomitantemente; HPV 6, em 11 amostras; HPV 11, em 7 amostras; e HPV 16, em uma.

Zhang et al. ⁹9 . Zhang ZY, Sdek P, Cao J, Chen WT. Human papillomavirus type 16 and 18 DNA in oral squamous cell carcinoma and normal mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg 2004; 1:71-4. encontraram HPV 16 e HPV 18 em 13 e 11 amostras de um total de 22 positivas, respectivamente. Duas amostras apresentaram ambos os tipos de HPV. Vale ressaltar que os autores pesquisaram apenas os tipos 16 e 18 e concluíram que a infecção por HPV é um evento comum na mucosa oral normal.

A associação entre infecção pelo HPV com faixa etária e sexo em indivíduos sem lesão na cavidade oral não foi estatisticamente significante neste estudo, apesar de a maioria da amostra ter menos de 50 anos e ser do sexo feminino, coincidindo com o encontrado por Llamas-Martinez et al. ¹¹11 . Llamas-Martínez S, Esparza-Gómez G, Campo-Trapero J, Cancela-Rodríguez P, Bascones-Martínez A, Moreno-López LA, et al. Genotypic determination by PCR-RFLP of human papillomavirus in normal oral mucosa, oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples in Madrid (Spain). Anticancer Res 2008; 28:3733-42..

Levando-se, em consideração, a importância dos agentes virais como fatores de risco, além do fumo e do álcool, para o desenvolvimento de câncer bucal e a mortalidade e sequelas que a doença pode causar na qualidade de vida das pessoas e inserção na sociedade, a realização de exames de biologia molecular para detecção dos agentes virais, especialmente o HPV, pode ser um excelente método para identificação de indivíduos com maior risco de desenvolvimento da carcinogênese oral, proporcionando diagnóstico precoce e facilitando o acompanhamento dos indivíduos infectados.

A concepção de que esses exames teriam alto custo não justifica sua exclusão como meio diagnóstico, já que o custo seria inferior aos efetuados com as despesas hospitalares advindas da cirurgia, radioterapia e quimioterapia, geralmente necessárias no tratamento do câncer bucal, pois os pacientes são detectados em estádio avançado, onerando o Sistema Único de Saúde, acrescido dos benefícios que podem trazer ao indivíduo, com um diagnóstico precoce, melhorando sua qualidade de vida.

Agradecimentos

Ao CNPq pelo apoio financeiro por meio do Edital MCT/CNPq/MS-SCTIE-DECIT/MS-SAS-DAB 32/2008. A Juliana Dias Aguiar e Nélida Cristina S. da Silva que colaboraram na obtenção da amostra.

Referências

Datas de Publicação

Histórico