RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de cloroquina (CQ) en linfocitos humanos a través del ensayo cometa. Los linfocitos fueron aislados de muestras de sangre periférica obtenidas de tres donantes sanos, no fumadores de 24 a 30 años. Los linfocitos aislados fueron expuestos durante una hora a diversos tratamientos: peróxido de hidrógeno 2,5 % (control positivo), buffer fosfato salino 1X (control negativo) y cloroquina a concentraciones de 0 µg/ml, 0,25 µg/ml; 5 µg/ml y 300 µg/ml. Se registró los promedios del porcentaje de ADN en la cola del cometa, momento de la cola y momento de la cola de Olive, encontrándose diferencias significativas entre las diversas concentraciones de CQ (p<0,01). Asimismo, la magnitud de daño del ADN se incrementó en función de la concentración de CQ. Se demostró el efecto genotóxico de CQ en linfocitos humanos expuestos in vitro.

Palabras clave:
Ensayo Cometa; Genotoxicidad; Cloroquina; Linfocitos; Malaria

ABSTRACT

The objective of the study was to evaluate the effect of chloroquine (CQ) on human lymphocytes through the Comet Assay. Lymphocytes were isolated from peripheral blood samples obtained from three healthy, non-smoking donors aged 24 to 30 years. The isolated lymphocytes were exposed for one hour to various treatments: hydrogen peroxide 2.5% (positive control), saline buffer phosphate 1X (negative control) and chloroquine at concentrations of 0 µg/ml, 0.25 µg/ml; 5 µg/ml and 300 µg/ml. The averages of the percentage of DNA in the comet tail, moment of tail and moment of Olive’s tail were recorded, with significant differences between the different concentrations of CQ (p<0.01). Also, the magnitude of DNA damage was increased as a function of the CQ concentration. The genotoxic effect of CQ was demonstrated in human lymphocytes exposed in vitro.

Keywords:
Comet Assay; Genotoxicity; Chloroquine; Lymphocytes; Malaria

INTRODUCCIÓN

La cloroquina (CQ) es un fármaco utilizado para el tratamiento de la malaria¹1. Chakir I, Ibrahim SA, Afane B, Jambou R. Control of malaria in the Comoro Islands over the past century. Malar J. 2017;16(1):387. doi: 10.1186/s12936- 017-2027-1.
https://doi.org/10.1186/s12936-... y otras patologías. En recientes investigaciones, se describe que la CQ potencia la quimioterapia y radioterapia debido a sus propiedades antitumorales, alta capacidad antiproliferativa e inhibidora de la autofagia y reparación del ADN ²2. Plantone D, Koudriavtseva T. Curret and Future use of Choroquine and Hydroxychloroquine in infectious, Inmune, Neoplastic and Neurological Diseases. Clin Drug Investig. 2018;38(8):653-671. doi: 10.1007/s40261-018-0656-y.
https://doi.org/10.1007/s40261-018-0656-... . No obstante, se reportan efectos secundarios a la terapia ³3. Bogaczewicz A, SobównT. Psychiatric adverse effects of chloroquine. Psychiatr Psychol Klin. 2017;17(2):111-4..

Inicialmente se propuso que el mecanismo de acción de la CQ, en el tratamiento de malaria, producía la muerte del parásito por intercalación con el ADN ⁴4. Meshnick SR. Chloroquine as intercalator: a Hypothesis revived. Parasitol Today. 1990;6(3):77-9.. Sin embargo, en años recientes se ha demostrado que inhibe la replicación del ADN, mediado por la acumulación del hemo al interior de la vacuola alimentaria del trofozoito y altera el metabolismo de reducción-oxidación, fijación de carbono y el metabolismo anaplerótico del ciclo del ácido tricarboxílico ⁵5. Tewari SG, Prigge ST, Reifman J, Wallqvist A. Using a genome-scale metabolic network model to elucidate the mechanism of chloroquine action in Plasmodium falciparum. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 2017;7(2):138-146. doi: 10.1016/j.ijpddr.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2017.03... .

A nivel genético, se presenta evidencia del efecto mutagénico de la CQ en Drosophila melanogaster⁶6. Xanema N, Creus A, Velásquez A, Marcos R. Testing of chloroquines and quinacrine for mutagenicity in Drosophila melanogaster. Mutat Res. 1985;158(3):177-80., roturas del ADN en células de hígado de ratas ⁷7. Farombi EO. Genotoxicity of chloroquine in rat liver cells: protective role of free radical scavengers. Cell Biol Toxicol; 2006;22(3):159-67., roturas cromosómicas en células de médula ósea y alteraciones en la morfología de los espermatozoides en Mesocricetus auratus⁸8. Cruz BM. Genotoxicidad de cloroquina en Mesocricetus auratur "hámster" [Tesis Doctoral]. Trujillo: Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo. 2009.. Contrariamente a estos reportes, en el bagre amarillo se observó que la CQ mejora la motilidad de los espermatozoides e incrementa su capacidad de fertilización ⁹9. Zhang J, Ma W, Xie B, Gui JF, Mei J. Beneficial effect and potential molecular mechanism of chloroquine on sperm motility and fertilizing ability in yellow catfish. Aquaculture. 2017; 468:307-13..

El uso frecuente de la CQ para distintas patologías, el bajo costo, el reporte de efectos secundarios, el periodo de tratamiento de tres a cuatro meses, el alto grado de toxicidad, la variación de concentraciones en los diferentes tejidos; constituyen factores que motivan a realizar pruebas para la determinación genotóxica de CQ, principalmente a bajas concentraciones, para lo cual, el ensayo cometa constituye una herramienta de alta sensibilidad aplicable en diferentes sistemas biológicos.

Por tal motivo, la presente investigación tiene como finalidad evaluar el daño inducido por la CQ en el ADN de linfocitos humanos de sangre periférica a través del ensayo cometa.

EL ESTUDIO

Se realizó un estudio de diseño transversal, en bloques al azar. Cada bloque corresponde a los linfocitos de un donante, los que fueron distribuidos en tubos de manera aleatoria y expuestos a un control negativo, un control positivo y a concentraciones de 0 µg/ml, 0,25 µg/ml, 5 µg/ ml y 300 µg/ml de CQ.

Se extrajo 10 ml de sangre periférica a tres donantes varones de 24 a 30 años, no fumadores, no expuestos a radiaciones ionizantes o químicos genotóxicos, al menos cuatro meses antes de la toma de muestra, debido al tiempo de semivida del fármaco ¹⁰10. Gustafsson LL, Walker O, Alván G, Beermann B, Estevez F, Gleisner L, et al. Disposition of chloroquine in man after single intravenous and oral doses. Br J Clin Pharmacol. 1983;15(4):471-9.. De las muestras de sangre se obtuvieron suspensiones de 3 x 10⁶ linfocitos, aproximadamente.

Se utilizó cloroquina difosfato de 250 mg (150 mg de cloroquina base) (Laboratorio Chile S.A.), la que fue homogenizada y diluida en 300 ml de buffer fosfato salino (PBS) 1X en agitación a 25 °C, durante 1 h. Se filtró utilizando membrana millipore de 0,22 µm (Merck). Se realizaron diluciones en concentraciones de 0 µg/ml, 0,25 µg/ml, 5 µg/ml y 300 µg/ml de CQ (equivalentes a las cantidades halladas en suero y orina) ¹¹11. Bygbjerg IC, Flachs H. 1986. Effect of chloroquine on human lymphocyte proliferation. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1986; 80(2):231-235.. Como control positivo, se utilizó peróxido de hidrógeno (H₂O₂) 2,5 % ¹²12. Sayer A, Hu Q, Bourdelais AJ, Baden DG, Gibson JE. The effect of brevenal on brevetoxin-induced DNA damage in human lymphocytes. Arch Toxicol. 2005; 79(11):683-8. (Laboratorio ALKOFARMA) y PBS 1X como control negativo. Los linfocitos fueron expuestos a estas soluciones durante 1 h a 25 ºC en oscuridad.

Para determinar la viabilidad celular se tomaron 20 µl de linfocitos después de la exposición a los tratamientos, se colorearon con ioduro de propidio 0,5 µl 1mM en oscuridad durante 10 min y se evaluaron al microscopio de fluorescencia Olympus BX51, con filtros 536 y 617 nm. En cada muestra obtenida se contó linfocitos coloreados (muertos) y sin coloración (vivos) haciendo un total de 200 linfocitos, con esta información se determinó el porcentaje de viabilidad de linfocitos:

% viabilidad= (número de linfocitos muertos )/(total de linfocitos) X 100

El ensayo cometa se realizó siguiendo el protocolo de Sayer et al¹²12. Sayer A, Hu Q, Bourdelais AJ, Baden DG, Gibson JE. The effect of brevenal on brevetoxin-induced DNA damage in human lymphocytes. Arch Toxicol. 2005; 79(11):683-8.. De cada muestra de linfocitos tratados se preparó 70 µL de linfocitos en 140 µL de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) al 1 % y se llevaron a lisis en NaCl 2,5 M, Na₂EDTA 100 mM, Tris HCl 10 mM, Tritón X-100 1 %, DMSO 10 % e incubaron a 4 ºC durante 4 h, la electroforesis a 25 V y 300 mA durante 30 min en buffer de Na₂EDTA 1 mM, NaOH 300 mM pH 13, la neutralización en solución Tris HCl pH 7,5 por 3 min y fijación en alcohol 96º por 3 min. Se coloreó con bromuro de etidio (20mg/ml) y analizó al microscopio de fluorescencia Olympus BX51 a 40X con filtros de 510 nm y 550 nm.

Se determinó el porcentaje de ADN de la cola del cometa (%TADN), momento de la cola (TM) y momento de Olive (OTM) como parámetros de genotoxicidad ¹³13. Reisinger K, Blatz V, Brinkman J, Downs TR, Fischer A, Henkler F, et al. Validation of de 3D skin Comet assay using full thickness skin models: Transferability and reproducibility. Mutat Res. 2018;827:27-41. doi: 10.1016/j.mrgentox.2018.01.003.
https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2018.... , para lo cual se utilizó el programa CASPLab (http://casplab.com). El linfocito dañado se asemeja a la forma de una cometa, con un núcleo redondeado (cabeza) que se continúa con una tinción más tenue en forma alargada (cola), el programa captura la imagen, la intensidad de fluorescencia de la cola delineada es comparada a la intensidad total del cometa para determinar el %TADN. El momento de la cola y el momento de Olive se calcularon por las siguientes formulas:

Momento de la cola (TM) = (longitud de la cola x %TADN) / (% total de ADN)

Momento de Olive (OTM) = distancia entre la cabeza y la cola x %TADN

El %TADN mide la cantidad de ADN existente en la cola en estado fragmentado y/o desplegado, mientras que TM y OTM representa la magnitud de rotura del ADN.

Se estimaron las medias y desviación estándar para el %TADN, TM y OTM. Los datos fueron ajustados a la distribución normal y se compararon mediante el análisis de varianza y Tukey. Para el análisis de regresión lineal se consideró la concentración de la CQ como variable independiente (función x) y como variables dependientes al %TADN, TM y OTM (función y), los coeficientes de regresión (β = covarianza x,y / suma de cuadrados de x) fueron estimados mediante el programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) para el análisis estadístico, se consideró un α = 0,05.

La investigación contó con la aprobación del Comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo (CIEI-FAC.MED-UNTE. cód. n.º21101403156). Además, los participantes firmaron el respectivo consentimiento informado.

HALLAZGOS

Los porcentajes de viabilidad de los linfocitos expuestos a las concentraciones de 0,25 µg/ml, 5 µg/ml y 300 µg/ml de CQ fueron 98,52 %; 98,37 % y 89,39 %, respectivamente. Asimismo, los porcentajes de viabilidad de los linfocitos expuestos al control negativo y al control positivo fueron de 99,48 % y de 94,67 %, respectivamente (Tabla 1).

Al evaluar visualmente el daño de la CQ en el ADN de linfocitos humanos de sangre periférica con el ensayo cometa, se observaron linfocitos con: A) ADN sin daño, B) ADN con daño de bajo nivel, C) ADN con daño moderado y D) ADN con daño elevado (Figura 1).

El %TADN presentó diferencias significativas a la concentración de 300 µg/ml en comparación con las concentraciones de 0,25 µg/ml y 5 µg/ml de CQ. Sin embargo, los valores promedios del TM y OTM fueron diferentes estadísticamente (p<0,001) a la concentración de 5 µg/ml en comparación con 0,25 µg/ml y 0 µg/ml (Figura 2). Asimismo, no se presentaron diferencias entre la concentración más baja de CQ con el control negativo. El control positivo con H₂O₂ 2,5 % presentó diferencias en todos los casos de tratamientos con CQ.

En la Figura 3 se muestra la relación lineal del porcentaje de ADN medido mediante %TDNA y OTM en función directa a la concentración de CQ; los coeficientes de regresión (β) fueron 3,49 y 2,27, respectivamente (p<0,01). El coeficiente de regresión del MT y concentración de CQ fue 3,43, (p<0,01). Los valores de correlación entre el %TDNA, TM y OTM con respecto a la concentración de CQ, fueron r=0,94, r=0,92 y r=0,92, respectivamente.

DISCUSIÓN

El ensayo cometa presenta mayor ventaja en la detección de genotóxicos, debido a la capacidad de resolver si un agente produce daños en el ADN a bajas dosis, manejo sencillo, bajo costo y reproducible ¹⁴14. Afanasieva K, Sivolob A. Physical principles and new applications of comet assay. Biophys Chem. 2018 Jul;238:1-7. doi: 10.1016/j.bpc.2018.04.003.
https://doi.org/10.1016/j.bpc.2018.04.00... . De allí, su aplicación en genética toxicológica.

Esta investigación muestra evidencias del efecto clastogénico de la CQ en linfocitos humanos de sangre periférica in vitro expuestos a diferentes concentraciones de CQ. Estos daños genéticos pueden presentarse en los diferentes tejidos y fluidos de pacientes tratados con CQ, desde concentraciones que fluctúan entre 0,05 µg/ml hasta 334,4 µg/ml ¹⁵15. Pussard E, Verdier F, Blayo MC. Simultaneous determination of chloroquine, amodiaquine and their metabolitesiIn human plasma, red blood cells, whole blood and urine by column liquid chromatography. J Chromatogr. 1986;374:111-118.^,1616. Houzé P, de Reynies A. Simultaneous determination of chloroquine and its three metabolites in human plasma, whole blood and urine by ion-pair highperformance liquid chromatography. J Chromatogr. 1992; 574:305-312..

El daño del ADN se demuestra con el incremento del %TDNA, TM y OTM en función al aumento de las concentraciones de CQ, en relación lineal directa. Así mismo, la viabilidad de los linfocitos por encima del 89,39 % en todos los tratamientos revelan que el porcentaje de daño del ADN de los linfocitos es a causa de CQ. La respuesta positiva de daño genético en el ensayo cometa se considera como punto de corte el 75 % de viabilidad celular ¹⁷17. Henderson L. Wolfreys A, Ferdyk J, Bourner C, Windebank S. The ability of the Comet assay to discriminate between genotoxins and cytotoxins. Mutagenesis. 1998; 13(1):89-94..

Las diferencias de viabilidad (98,37 %) de los linfocitos de sangre periférica directamente expuestos a CQ registradas en el presente estudio en comparación con la viabilidad (50 %) de los linfocitos de sangre periférica en cultivo expuestas a la misma concentración de 5 µl ¹¹11. Bygbjerg IC, Flachs H. 1986. Effect of chloroquine on human lymphocyte proliferation. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1986; 80(2):231-235., así como, en las concentraciones de H₂O₂, en cultivo (100µM) ¹⁸18. Zivkovic L, Borozan S, Cabarkapa A, Topalovic D, Ciptasari U, Bajic V, et al. Antigenotoxic Properties of Agaricus blazei against Hydrogen Peroxide in Human Peripheral Blood Cells. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:8759764. doi: 10.1155/2017/8759764.
https://doi.org/10.1155/2017/8759764... y directamente expuesto (734 mM) ¹²12. Sayer A, Hu Q, Bourdelais AJ, Baden DG, Gibson JE. The effect of brevenal on brevetoxin-induced DNA damage in human lymphocytes. Arch Toxicol. 2005; 79(11):683-8. utilizadas como control positivo; constituyen pruebas que el daño del ADN depende de la estructura y estado funcional de los linfocitos expuestos a CQ in vitro.

Los linfocitos maduros que tienen mayor grado de empaquetamiento del ADN presentarán mayor resistencia al daño, en comparación a las células en estado proliferativo, debido a los procesos activos de replicación y transcripción. Ensayos de resistencia en diferentes subpoblaciones de linfocitos, encuentran alta sensibilidad a mutágenos en los linfocitos B y mayor resistencia en los linfocitos T ¹⁹19. Weng H, Morimoto K. Differential responses to mutagens among human lymphocyte subpopulations. Mutat Res. 2009;672(1):1-9. doi: 10.1016/j.mrgentox.2008.10.010.
https://doi.org/10.1016/j.mrgentox.2008.... . A estas variaciones, se sumarían los efectos epigenéticos, centrándose en la acción de los microARN, metilación del ADN y modificación de las histonas, que actúan modificando la accesibilidad del ADN a los mutágenos ²⁰20. Chappell GA, Rager JE. Epigenetics in chemical-induced genotoxic carcinogenesis. Curr Opin Toxicol. 2017; 6:10-17. doi: 10.1016/j.cotox.2017.06.007.
https://doi.org/10.1016/j.cotox.2017.06.... , cambios que podrían generar diferencias en individuos expuestos a las mismas dosis e igual tiempo de exposición a la CQ.

Entre las limitaciones del estudio se puede mencionar que, a pesar de haber trabajado con linfocitos humanos de sangre periférica, se ha observado vulnerabilidad del ADN. Es probable que el daño del ADN por CQ sea mayor cuando los linfocitos se encuentren en su medio natural, debido a su estado funcional y diferentes grados de maduración. Los linfocitos aislados in vitro mostraron viabilidad tan igual que el control negativo, lo que sustenta que las roturas del ADN se deben a la CQ.

Será importante la realización de estudios sobre la actividad antiapotótica y antirreparador de la replicación del ADN producida por CQ, así como la evaluación de los efectos secundarios que conllevan tratamientos prolongados.

Se concluye que la CQ induce el aumento significativo de lesiones en el ADN de linfocitos humanos de sangre periférica, reflejadas en el incremento del %TDNA, MT y OTM en función de las concentraciones de 0,25 µg/ml; 5 µg/ml y 300 µg/ml de CQ.

Referencias Bibliográficas

Fechas de Publicación

Histórico