RESUMEN

Se evaluó la efectividad de diversas formulaciones farmacéuticas de ketoconazol en modelos experimentales de leishmaniasis cutánea (LC) en ratones BALB C. Fueron preparadas formulaciones tópicas tipo gel, lipogel y crema conteniendo potenciadores de la permeación y diferentes concentraciones de ketoconazol. Se determinó la estabilidad, la toxicidad y la actividad anti-Leishmania in vitro. Además, se evaluó in vivo la efectividad de las formulaciones aplicadas tópicamente en ratones con LC infectados con Leishmania (Viannia) braziliensis. Las formulaciones tipo crema fueron evaluadas adicionalmente en ratones infectados con L. (V.) panamensis. Los sistemas evaluados mantuvieron in vitro la actividad del ketoconazol contra los parásitos; sin embargo, ninguna de las formulaciones fue efectiva en curar las lesiones de LC en los ratones. El tratamiento tópico con miltefosina (utilizado como control) curó las lesiones. Se concluye que las formulaciones que contienen ketoconazol diseñados en este estudio, no fueron efectivos contra la LC en los ratones infectados.

Palabras clave:
Leishmania (Viannia) braziliensis; Leishmania (Viannia) panamensis; Ratones consanguíneos BALB C; Administración tópica

ABSTRACT

The effectiveness of various pharmaceutical formulations of ketoconazole was evaluated in experimental models of cutaneous leishmaniasis (LC) in BALB C mice. Topical gel, lipogel, and cream formulations containing permeation enhancers and different concentrations of ketoconazole were prepared. Stability, toxicity and anti-Leishmania activity were determined in vitro. In addition, the effectiveness of topically applied formulations in LC-infected mice infected with Leishmania (Viannia) braziliensis was evaluated in vivo. Cream formulations were additionally evaluated in mice infected with L. (V.) panamensis. The systems evaluated maintained in vitro the activity of ketoconazole against parasites; however, none of the formulations were effective in curing LC lesions in mice. Topical treatment with miltefosine (used as a control) cured the lesions. It is concluded that the ketoconazole-containing formulations designed in this study were not effective against LC in infected mice.

Keywords:
Leishmania (Viannia) braziliensis; Leishmania (Viannia) panamensis; Inbred BALB C mice; Topical administration

INTRODUCCIÓN

La leishmaniasis son un grupo de enfermedades causadas por parásitos intracelulares del género Leishmania, transmitida a los humanos por insectos flebótomos. Sus manifestaciones clínicas varían según la especie de parásito involucrada y el estado inmune del hospedero, desde leishmaniasis visceral hasta formas asintomáticas o leves de leishmaniasis cutánea (LC) ¹1. Alvar J, Vélez I,Bern C,Herrero M,Desjeux P, Cano J et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS ONE. 2012; 7(5):e35671. doi: 10.1371/journal.pone.0035671.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.003... . La leishmaniasis del Nuevo Mundo (especialmente producida por especies del subgénero Viannia) constituye la forma más polimórfica de la enfermedad, encontrándose distribuida ampliamente en Brasil, Colombia y Perú ²2. Rodríguez G, Arenas C, Ovalle C, Hernández C. Las Leishmaniasis: atlas y texto. 1era edición. Bogotá: Editorial Panamericana; 2016 p. 91-106.. El tratamiento está basado en el uso parenteral de antimoniales pentavalentes, y en caso de falla terapéutica o contraindicaciones se puede usar pentamidina, anfotericina B, sus formas liposomales o miltefosina. Algunos pacientes presentan efectos adversos serios como cardiopatías, nefropatías y pancreatitis. La eficacia del tratamiento se ve afectada por la especie de Leishmania, la edad del paciente, el estado inmune y el tiempo de evolución de las lesiones ³3. Blum J, Lockwood D, Visser L, Harms G, Bailey M, Caumes E et al. Local or systemic treatment for New World cutaneous leishmaniasis? Re-evaluating the evidence for the risk of mucosal leishmaniasis. Int Health. 2012; 4(3):153-63. doi: 10.1016/j.inhe.2012.06.004.
https://doi.org/10.1016/j.inhe.2012.06.0... . En pacientes con contraindicaciones los tratamientos tópicos son una alternativa atractiva, debido a que son de fácil administración, bajo costo y baja toxicidad; sin embargo, por el riesgo de diseminación, deben aplicarse con precaución y en combinación con otros fármacos ³3. Blum J, Lockwood D, Visser L, Harms G, Bailey M, Caumes E et al. Local or systemic treatment for New World cutaneous leishmaniasis? Re-evaluating the evidence for the risk of mucosal leishmaniasis. Int Health. 2012; 4(3):153-63. doi: 10.1016/j.inhe.2012.06.004.
https://doi.org/10.1016/j.inhe.2012.06.0... .

El ketoconazol (KTZ) es un imidazol de amplio espectro utilizado en el tratamiento de infecciones micóticas. Su uso oral ha sido restringido por la Food and Drug Administration (FDA) desde el 2013 ⁴4. Food and Drug Administration [Internet]. Maryland: FDA; 2017. [Citado el 22 de febrero 2018]. FDA Drug Safety Communication: FDA limits usage of Nizoral (ketoconazole) oral tablets due to potentially fatal liver injury and risk of drug interactions and adrenal gland problems; [dos pantallas] Disponible en https://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm362415.htm
https://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm... ; sin embargo, se encuentra disponible en diversos sistemas farmacéuticos (SF) de aplicación tópica como geles, cremas, aerosoles, espumas y champús (https://www.drugbank.ca/drugs/DB01026) utilizados principalmente en infecciones fúngicas superficiales y en dermatitis seborreica. El KTZ es un inhibidor de la 14-α demetilasa (una enzima del citocromo P-450) necesaria en la conversión del lanosterol en ergosterol en hongos y Leishmania⁵5. McCall LI, El Aroussi A, Choi JY, Vieira DF, De Muylder G, Johnston JB, et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: essentiality of sterol 14 alpha-demethylase PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(3):e0003588. doi: 10.1371/journal.pntd.0003588.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000... .

Algunos ensayos clínicos que han utilizado KTZ a 600 mg/día/oral durante 28 días, han mostrado eficacias del 76 % y 89 % en el tratamiento de LC por L. (L.) mexicana y L. (V.) panamensis, respectivamente y del 30 % en casos de LC por L. (V.) braziliensis ⁶6. Saenz RE, Paz H, Berman JD. Efficacy of ketoconazole against Leishmania brazil- iensis panamensis cutaneous leishmaniasis. Am J Med. 1990; 89(2):147-55.^-77. Navin TR, Arana BA, Arana FE, Berman JD, Chajón JF. Placebo-controlled clinical trial of sodium stibogluconate (Pentostam) versus ketoconazole for treating cutaneous leishmaniasis in Guatemala. J Infect Dis. 1992; 165(3):528-34.. Los resultados sobre su efectividad tópica (crema al 2 %) son pocos y desalentadores ⁸8. Restrepo M, Gomez M. Tratamiento de la leishmaniasis cutanea con ketoconazol. Acta Médica Colomb. 1987;12(4):294-7.

9. Abahusein A, Larbi E, al-Khawajah A, al-Gindan Y, Jain S. Evaluation of topical ketoconazole in cutaneous leishmaniasis. East Afr Med. 1992; 69(1):14-7.^-1010. Momeni AZ, Aminjavaheri M, Omidghaemi MR. Treatment of cutane- ousleishmaniasiswithketoconazolecream. J Dermatolog Treat. 2003;14(1):26-9.. Nuevos sistemas farmacéuticos de ketoconazol (SF- KTZ) en forma de espumas y geles han dado lugar a un «renacimiento» del uso de KTZ tópico para el tratamiento de enfermedades de la piel como dermatitis seborreica u otras entidades dermatológicas ¹¹11. Scheinfeld N. Ketoconazole: a review of a workhorse antifungal molecule with a focus on new foam and gel formulations. Drugs Today (Barc). 2008; 44(5):369-80. doi: 10.1358/dot.2008.44.5.1216598
https://doi.org/10.1358/dot.2008.44.5.12... . Igualmente, los SF-KTZ conteniendo potenciadores de la permeación percutánea (PPP) (p. ej. surfactantes, terpenos) y nuevos sistemas de

El objetivo de este trabajo fue diseñar y evaluar la efectividad de diversos SF-KTZ conteniendo diversos PPP en modelos experimentales de LC en ratones BALB C.

MENSAJES CLAVE

Motivación para realizar el estudio. Las formulaciones de aplicación tópica en piel constituyen una alternativa de tratamiento para la leishmaniasis cutánea (LC) en pacientes que presentan contraindicaciones al tratamiento habitual con antimoniales.

Principales hallazgos. Los sistemas farmacéuticos conteniendo ketoconazol (SF-KTZ) evaluados in vitro fueron efectivos en el tratamiento de LC; sin embargo, ninguno de los SF-KTZ aplicados tópicamente logro curar a los ratones infectados con LC.

Implicancias. Es necesario la investigación de nuevos sistemas farmacéuticos que permitan una mejor absorción del ketoconazol en modelos experimentales con ratones.

EL ESTUDIO

PREPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

Se prepararon SF-KTZ tipo gel, cremas y lipogeles que contienen liposomas ultradeformables (LUD) con o sin KTZ o PPP (Tabla 1). Para los geles, el Carbopol 940® (1% p/p) se disolvió en agua destilada y posteriormente se agregó el benzoato sódico al 0,1%, el KTZ y los PPP por agitación constante. La solución fue neutralizada con TEA hasta formar un gel transparente. Para las cremas, la fase acuosa (agua, glicerina, trietanolamina y benzoato de sodio) fue mezclada con la fase oleosa (ácido esteárico y cutina) en agitación continua a 75 °C en baño María. Posteriormente se agregó el KTZ, los PPP y la vitamina E hasta obtener una homogenización completa. Los LUD con KTZ fueron preparados utilizando el método de hidratación de una película fina según lo descrito por Hernández et al. ¹³13. Hernandez IP, Montanari JAM, Escobar P. Actividad in vitro contra Leishmania y permeación en piel humana de liposomas ultradeformables de miltefosina. Rev Cuba Med Trop 2014; 66 (3):370-85.. Los liposomas fueron adicionados a los geles hasta obtener un sistema homogéneo.

Los SF-KTZ y sus vehículos fueron caracterizados determinándose su color, aspecto y pH a 4 °C, 28 °C y 37 °C por 30 días. El tamaño de partícula, potencial zeta y el índice de polidispersión (PDI) de los LUD fue determinado utilizando un Zetasizer (Malvern Nano ZS® 90).

PARÁSITOS Y CÉLULAS

Los promastigotes de L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/ M2903) y L. (V.) panamensis (MHOM/PA/71/LS94) fueron cultivados en medio Schneider suplementado con 10 % de suero fetal bovino e inactivado con calor (SFBi) a 28 °C. La línea celular monocítica humana (THP-1, ATCC TIB-202) fue mantenida en medio de cultivo RPMI 1640 y 10 % de SBFi a 37 °C, 5 % de CO y 95 % de humedad. Los amastigotes intracelulares se obtuvieron infectando las células THP-1 con promastigotes en una relación célula: parásito de 1:5 por 48 horas ¹³13. Hernandez IP, Montanari JAM, Escobar P. Actividad in vitro contra Leishmania y permeación en piel humana de liposomas ultradeformables de miltefosina. Rev Cuba Med Trop 2014; 66 (3):370-85..

ENSAYOS IN VITRO

Los parásitos y células fueron tratados con diluciones seriadas 1:3 de KTZ libre (en solución) y los SF-KTZ durante 72 horas. Las células control fueron mantenidas sin compuesto. La inhibición del crecimiento parasitario fue determinada microscópicamente por conteo directo de promastigotes o por recuento de células infectadas con amastigotes. La toxicidad en las células THP-1 fue determinada utilizando el método colorimétrico de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) calculando el porcentaje de citotoxicidad (%CC).

La actividad de los compuestos fue expresada como la concentración inhibitoria o citotóxica para el 50 % de las células (CI y CC 50) calculada por análisis de regresión sigmoidal ¹³13. Hernandez IP, Montanari JAM, Escobar P. Actividad in vitro contra Leishmania y permeación en piel humana de liposomas ultradeformables de miltefosina. Rev Cuba Med Trop 2014; 66 (3):370-85..

ENSAYOS IN VIVO

Los ratones fueron infectados con promastigotes en fase estacionaria (5 x 105 parásitos) en el dorso. Después de 8-12 semanas (lesiones aproximadamente de 30 mm2), los animales fueron tratados con una dosis diaria de cada SF- KTZ, sobre las lesiones por 60 días.

Se conformaron 13 grupos con dos ratones en cada uno. Todos los tratamientos fueron evaluados en ratones infectados con L. (V.) braziliensis. Adicionalmente en los grupos del 8 al 13 se incluyeron ratones infectados con L. (V.) panamensis. El total se utilizaron 38 ratones, de acuerdo con las siguiente secuencia y tratamiento:

Grupo 1-5: diez ratones tratados con SF-KTZ tipo gel (gel 1-gel 4 y gel sin KTZ).

Grupo 6-7: cuatro ratones tratados con lipogel, con y sin KTZ. Grupo 8-12: 20 ratones tratados con SF-KTZ tipo crema (diferentes porcentajes de KTZ y crema sin KTZ).

Grupo 13: cuatro ratones tratados con miltefosina.

Semanalmente se midieron las lesiones (nódulo y úlcera) utilizando un medidor digital. Los ratones se sacrificaron 15 días después de terminar el tratamiento utilizando una mezcla de anestésicos (Ketamina/Xilacina) vía intraperitoneal. Se realizaron extendidos en láminas portaobjetos de las lesiones y se recolectaron biopsias de las lesiones, hígado y bazo. Se comparó el tamaño de las lesiones (mm2) con el vehículo y la presencia/ausencia de parásitos en los extendidos y biopsias. Los fragmentos de órganos fueron fijados con formalina al 10 % por 24 horas y posteriormente incluidos en bloques de parafina. Se realizaron cortes de cinco μm los cuales fueron coloreados con hematoxilina-eosina.

PRUEBA DE IRRITACIÓN

Fue realizada según el método descrito en la prueba número 404 Irritación/Corrosión Dérmica Aguda de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD) (https://goo.gl/L28Duh). Los ratones sanos fueron tratados tópicamente con cada SF-KTZ por siete días. Las lesiones se clasificaron como 0 (sin eritema), 1 (eritema ligero), 2 (eritema bien definido), 3 (eritema moderado o severo) y 4 (eritema grave).

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se utilizó la prueba de ANOVA de una vía para comparar los diferentes grupos. Un valor de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

CONSIDERACIONES ÉTICAS Y MANTENIMIENTO DE ANIMALES

El presente trabajo contó con el aval del Comité de Ética de la Universidad Industrial de Santander, código 2016-P10CI015. Los ratones fueron mantenidos a 20 ± 3 °C, en fotoperiodos de luz/oscuridad de 12 horas, con alimento y agua ad libitum.

HALLAZGOS

CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DE LOS SF-KTZ

Los SF-KTZ tipo gel fueron de color blanco, aspecto homogéneo, pH 5-6 y extensibilidad del 0,78 a 1,28 siendo mayor en el Gel 4 (1,5 %) (gel sin PPP). Las cremas de KTZ mostraron un color blanco, aspecto homogéneo, pH 7 y extensibilidad entre 0,5 y 0,78 siendo la menos extensible la crema 3 (15 %).

Los geles, lipogeles y cremas fueron estables por 30 días a 4 °C y 28 °C en oscuridad. El gel 1 y 2 y las cremas cambiaron de color a anaranjado-rosado a 37 °C.

El tamaño, potencial Z y PDI en los LUD de KTZ fue de 86,26 ± 1,32 nm, -18,6 ± 0,85 mV y 0,135, respectivamente, y en los LUD vacíos fue de 119,3 ± 2,95 nm, -35,3 ± 1,92 mV y 0,156, respectivamente. Fueron estables a 4 °C hasta por 30 días.

ACTIVIDAD IN VITRO

Los promastigotes fueron susceptibles al tratamiento con los SF-KTZ tipo crema conteniendo KTZ al 2 %, 10 % y 15 %, respectivamente. El KTZ libre (en solución) mostró actividad en promastigotes y amastigotes intracelulares (CI₅₀<5,03 µg/mL y 6,12µg/mL, respectivamente) y células (CC32,5 µg/mL) (Figura 1). Los vehículos no mostraron actividad contra parásitos ni células THP-1 (datos no incluidos).

EFECTIVIDAD DE LAS FORMULACIONES DE KTZ EN RATONES

Ninguno de los tratamientos fue efectivo en ratones con LC (Figura 2 y 3). Después del tratamiento, las lesiones de los ratones infectados con L. (V.) braziliensis se incrementaron de 23,1 % a 96,7 % y en los ratones infectados con L. (V.) panamensis se incrementaron de 45,17 % a 89,26 %, similar al tratamiento con los SF-KTZ tipo crema se muestran en la Figura 2. Se observaron parásitos en todos los extendidos y biopsias de lesiones. No se encontraron parásitos en las biopsias de bazo e hígado. No se observaron cambios en el peso corporal o en la ingesta de alimentos y agua. El tratamiento tópico con miltefosina fue efectivo en los ratones tratados.

IRRITACIÓN DE LOS TRATAMIENTOS

Ninguno de los tratamientos fue irritante para los ratones.

DISCUSIÓN

El tratamiento tópico con KTZ en LC no ha mostrado resultados satisfactorios ⁸8. Restrepo M, Gomez M. Tratamiento de la leishmaniasis cutanea con ketoconazol. Acta Médica Colomb. 1987;12(4):294-7.

9. Abahusein A, Larbi E, al-Khawajah A, al-Gindan Y, Jain S. Evaluation of topical ketoconazole in cutaneous leishmaniasis. East Afr Med. 1992; 69(1):14-7.^-1010. Momeni AZ, Aminjavaheri M, Omidghaemi MR. Treatment of cutane- ousleishmaniasiswithketoconazolecream. J Dermatolog Treat. 2003;14(1):26-9.. Algunas de sus características fisicoquímicas podrían afectar su absorción y difusión hacia las capas profundas de la piel y por ende su efectividad. El KTZ es una base débil con baja solubilidad en agua y alto peso molecular. Se sabe que compuestos de bajo peso molecular presentan una mejor difusión a través del estrato córneo de la piel ¹⁴14. Durand C, Alhammad A, Willett KC. Practical considerations for optimal trans- dermal drug delivery. Am J Health Syst Pharm. 2012; 15;69(2):116-24. doi: 10.2146/ajhp110158.
https://doi.org/10.2146/ajhp110158.... . Sin embargo, su baja solubilidad en agua y relativa efectividad a bajas concentraciones in vitro (CI 6,12 µg/mL) podrían constituir factores a su favor, por lo que este fármaco incluido en SF adecuados podría mostrar una mejor absorción y difusión hacia las capas al incremento en los controles. La evolución de las lesiones profundas de la piel¹⁴14. Durand C, Alhammad A, Willett KC. Practical considerations for optimal trans- dermal drug delivery. Am J Health Syst Pharm. 2012; 15;69(2):116-24. doi: 10.2146/ajhp110158.
https://doi.org/10.2146/ajhp110158.... .

A diferencia del tratamiento tópico con miltefosina utilizado como control, los SF utilizados no fueron efectivos en LC. Sin embargo, se lograron formulaciones estables, de características fisicoquímicas recomendadas para un tratamiento tópico, capaces de incluir diversos porcentajes del fármaco y PPP reconocidos (dimetilsulfoxido, ácido oleico o un terpeno) y de mantener la actividad del fármaco in vitro contra los parásitos.

La presencia del dimetilsulfoxido (DMSO) era una opción importante. Este es un compuesto no tóxico y seguro, con actividad a nivel de los fosfolípidos de la bicapa lipídica, utilizado en algunos SF tópicos; por ejemplo, en diclofenaco sódico o en LC de viejo mundo en donde una formulación de KTZ al 2 % y DMSO al 20 %, aplicado cinco veces al día por un mes mostró una eficacia del 89 %, induciendo una destrucción más rápida de los parásitos en las lesiones ¹⁵15. Dutz W, Agarval N, Bashardost MZ, Bentley G, Kindmark CO. Topical therapy of cutaneous leishmaniasis with 2% ketoconazole ointment and DMSO. Int J Dermatol. 1987; 26(3):199..

Se obtuvieron vesículas (LUD tipo transferosoma) homogéneas, nanométricas y estables las que fueron incluidas uniformemente en un gel; sin embargo, tampoco fueron eficaces. Este tipo de liposomas (LUD-miltefosina) fueron preparados previamente por nuestro grupo induciendo una mayor liberación del fármaco en piel en comparación con el preparado no encapsulado ¹³13. Hernandez IP, Montanari JAM, Escobar P. Actividad in vitro contra Leishmania y permeación en piel humana de liposomas ultradeformables de miltefosina. Rev Cuba Med Trop 2014; 66 (3):370-85.. Otros sistemas vesiculares, microemulsiones y nanopartículas conteniendo KTZ han sido preparados mejorando su eficacia antifúngica y permitiendo una mayor permeación del fármaco en piel (15-20). Estos sistemas coloidales podrían ser candidatos para ser evaluados en LC.

Dada la ineficacia de las cremas de KTZ en los ratones infectados con L. (V.) braziliensis, se decidió evaluarlas en L. (V.) panamensis, esto debido a la especificidad de la especie, mostrada en ensayos clínicos con KTZ oral ⁶6. Saenz RE, Paz H, Berman JD. Efficacy of ketoconazole against Leishmania brazil- iensis panamensis cutaneous leishmaniasis. Am J Med. 1990; 89(2):147-55.^-77. Navin TR, Arana BA, Arana FE, Berman JD, Chajón JF. Placebo-controlled clinical trial of sodium stibogluconate (Pentostam) versus ketoconazole for treating cutaneous leishmaniasis in Guatemala. J Infect Dis. 1992; 165(3):528-34.. Los resultados fueron igualmente negativos.

Es importante mencionar, como limitación, que sólo se incluyeron dos ratones por grupo; esto debido a la dificultad del modelo utilizado en la generación de lesiones (sólo en el 40 % de los infectados), sin embargo, dada las características de las lesiones (nodulares grandes, ulceradas, con alta concentración de parásitos, incapaces de curar espontáneamente), en las que se utilizaron SF-KTZ con diferentes concentraciones de fármaco (1-15 %), pensamos que los resultados obtenidos nos brindan indicios de la poca eficacia del KTZ en el tratamiento de la LC producida por estas dos especies de Leishmania.

En conclusión, los SF-KTZ administrados tópicamente no fueron eficaces frente a la LC causada por L. (V.) braziliensis y L. (V.) panamensis en los ratones utilizados. Estudios de permeación del KTZ in vivo utilizando otros sistemas farmacéuticos o PPP que permitan una mejor absorción del KTZ en piel son recomendados.

Agradecimientos:

Agradecemos a la Vicerrectoría de Investigación y Extensión de la Universidad Industrial de Santander y a COLCIENCIAS por el apoyo en la realización del presente proyecto.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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