Multidrogorresistencia de Salmonella infantis en Perú: un estudio mediante secuenciamiento de nueva generación

Multidrug resistance of Salmonella infantis in Peru: a study through next generation sequencing

Willi Quino Carmen Verónica Hurtado Oscar Escalante-Maldonado Diana Flores-León Orson Mestanza France Vences-Rosales María Luz Zamudio Ronnie G. Gavilán Acerca de los autores

RESUMEN

Objetivos.

Describir los patrones fenotípicos y genotípicos de la resistencia antimicrobiana de Salmonella Infantis en Perú.

Materiales y Métodos.

Se analizaron 297 cepas de Salmonella sp. remitidas al Instituto Nacional de Salud (INS) en el periodo 2014-2016. Las cepas fueron caracterizadas fenotípicamente mediante pruebas microbiológicas, serológicas y de susceptibilidad antimicrobiana. En base a los patrones de resistencia antimicrobiana se seleccionaron 46 cepas que fueron caracterizadas genéticamente mediante secuenciamiento de nueva generación.

Resultados.

Se identificaron 193/297 (65,0%) cepas de Salmonella Infantis, de la cuales 143 (74,1%) fueron multidrogorresistentes productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Con el secuenciamiento genómico se evidenció un nuevo perfil para Salmonella Infantis, además, se identificó la presencia de 15 diferentes determinantes genéticos de resistencia a los antimicrobianos codificados en cromosoma bacteriano y cinco codificados en un megaplásmido. Los patrones de resistencia fenotípicos y genotípicos coincidieron, a excepción de la ceftazidima. Asimismo, las 46 cepas presentaron resistencia y/o sensibilidad disminuida a las quinolonas.

Conclusiones.

Salmonella Infantis se ha convertido en una de las serovariedades más frecuentemente referidas al INS, la cual incluye cepas multidrogoresistentes productoras de BLEE con resistencia a las quinolonas. Finalmente, se reafirma la relevancia del secuenciamiento de nueva generación en la caracterización de nuevas variantes de patógenos de importancia para la salud pública y su uso potencial en los sistemas de vigilancia de resistencia antimicrobiana.

Palabras clave:
Salmonella; Resistencia a múltiples fármacos; Secuenciación completa de genoma

ABSTRACT

Objectives.

To describe the phenotypic and genotypic patterns of the antimicrobial resistance of Salmonella Infantis in Peru.

Materials and Methods.

Two hundred and ninety-seven strains of Salmonella sp. submitted to the National Institute of Health (INS, in Spanish) during 2014-2016 were analyzed. The strains were phenotypically characterized by microbiological, serological, and antimicrobial susceptibility tests. Based on antimicrobial resistance patterns, 46 strains were selected and genetically characterized by next generation sequencing.

Results.

193/297 (65%) strains of Salmonella Infantis were identified, of which 143 (74.1%) were multidrug-resistant producers of extended spectrum beta-lactamases (ESBL). The genomic sequencing evidenced a new profile for Salmonella Infantis; additionally, it identified the presence of 15 different genetic determinants of antimicrobial resistance coded in bacterial chromosome and five coded in a megaplasmid. The phenotypic and genotypic resistance patterns matched, with the exception of ceftazidime. Moreover, the 46 strains presented resistance and/or decreased sensitivity to quinolones.

Conclusions.

Salmonella Infantis has become one of the sero-varieties most frequently referred to the INS, which includes ESBLproducing multidrug-resistant strains with resistance to quinolones. Finally, the relevance of next generation sequencing is reasserted in the characterization of new variants of pathogens that are important for public health, and their potential use in antimicrobial resistance surveillance systems.

Keywords:
Salmonella; Multidrug resistance; Complete genome sequencing

INTRODUCCIÓN

MENSAJES CLAVE

Motivación para realizar el estudio. En los últimos años se ha observado un incremento inusual de casos de salmonella de origen humano reportados al Instituto Nacional de Salud (INS) y un aumento en las detecciones fenotípicas de betalactamasas de espectro extendido, así como la resistencia in vitro a otros antimicrobianos.

Principales hallazgos. Se determinó una mayor frecuencia de Salmonella Infantis respecto a otras serovariedades de Salmonella remitidas al INS en el periodo 2014-2016. Se identificó 13 perfiles fenotípicos de multidrogoresistencia asociados a estas cepas, la presencia de genes de resistencia asociados a un megaplásmido y al cromosoma se confirmaron mediante secuenciamiento de nueva generación.

Implicancias. El secuenciamiento de nueva generación es la herramienta de elección, ya que brinda información necesaria para determinar el patrón de resistencia completo, el cual podría servir para trazar una apropiada estrategia de salud pública en Perú.

Salmonella enterica subespecie enterica es causante de la salmonelosis en los seres humanos y es considerada como una de las etiologías más importantes debido a su impacto en la salud pública y en la sanidad animal. Existen más de 2500 serovariedades de Salmonella enterica subespecie enterica11. Andino A, Hanning I. Salmonella enterica: Survival, Colonization, and Virulence Differences among Serovars. ScientificWorldJournal. 2015;2015:520179. doi: 10.1155/2015/520179.
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, siendo las serovariedades Enteritidis y Typhimurium las de mayor importancia tanto en países desarrollados como en desarrollo 22. Rodrigue DC, Tauxe RV, Rowe B. International increase in Salmonella enteritidis: a new pandemic? Epidemiol Infect. 1990;105(1):21-7.. Sin embargo, recientemente la serovariedad Infantis (Salmonella Infantis) ha tomado protagonismo debido a que presenta frecuentemente un fenotipo resistente a los antimicrobianos 33. Zamudio ML, Meza A, Bailón H, Martinez-Urtaza J, Campos J. Experiencias en la vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 2011;28:128-35.. Las circunstancias de aparición y propagación de la resistencia a los antimicrobianos son complejas. Epidemiológicamente, se ha descrito que una de las causas más importantes es el uso generalizado de agentes antimicrobianos en animales de consumo humano 44. Su L-H, Chiu C-H, Chu C, Ou JT. Antimicrobial resistance in nontyphoid Salmonella serotypes: a global challenge. Clin Infect Dis. 2004;39(4):546-51..

Recientes estudios usando técnicas de biología molecular, han mejorado el entendimiento de la presencia de resistencia en los antimicrobianos para Salmonella, la que está asociada con genes de resistencia específicos a ciertos antimicrobianos y a genes de resistencia con objetivos múltiples 55. Poppe C, Martin LC, Gyles CL, Reid- Smith R, Boerlin P, McEwen SA, et al. Acquisition of resistance to extendedspectrum cephalosporins by Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport and Escherichia coli in the turkey poult intestinal tract. Appl Environ Microbiol. 2005;71(3):1184-92.. La técnica del secuenciamiento de nueva generación permite obtener la información genómica completa de los genes vinculados a la resistencia antimicrobiana 66. McDermott PF, Tyson GH, Kabera C, Chen Y, Li C, Folster JP, et al. Whole-Genome Sequencing for Detecting Antimicrobial Resistance in Nontyphoidal Salmonella. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(9):5515-20. doi: 10.1128/AAC.01030-16.
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, además tiene aplicabilidad en los sistema de vigilancia para predecir la susceptibilidad antimicrobiana a Salmonella77. Ellington MJ, Ekelund O, Aarestrup FM, Canton R, Doumith M, Giske C, et al. The role of whole genome sequencing in antimicrobial susceptibility testing of bacteria: report from the EUCAST Subcommittee. Clin Microbiol Infect. 2017;23(1):2-22. doi: 10.1016/j.cmi.2016.11.012.
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.

En Perú se presenta un panorama similar. En el 2011, se presentó el último reporte donde la Salmonella Infantis se ubicó como la tercera serovariedad más frecuente 33. Zamudio ML, Meza A, Bailón H, Martinez-Urtaza J, Campos J. Experiencias en la vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 2011;28:128-35.. La importancia del estudio de la Salmonella Infantis no se da sólo por la frecuencia de casos sino por la presencia de resistencia a más de dos antimicrobianos 88. Silva C, Betancor L, García C, Astocondor L, Hinostroza N, Bisio J, et al. Characterization of Salmonella enterica isolates causing bacteremia in Lima, Peru, using multiple typing methods. PLoS One. 2017;12(12):e0189946. doi: 10.1371/journal.pone.0189946.
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y la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) 33. Zamudio ML, Meza A, Bailón H, Martinez-Urtaza J, Campos J. Experiencias en la vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 2011;28:128-35..

A nivel hospitalario, las bacterias productoras de BLEE son causantes del incremento de morbilidad y mortalidad. Las consecuencias de ignorar su presencia, puede condicionar al fracaso del tratamiento debido a un uso inapropiado de antibióticos, lo que conllevaría a aumentar la resistencia y la diseminación de este tipo de microorganismos. Asimismo, en Perú se han identificado pocas investigaciones que usen el secuenciamiento de nueva generación.

El objetivo del presente estudio es describir por primera vez los perfiles fenotípicos y genéticos de resistencia a los antibióticos de Salmonella Infantis, en muestras remitidas al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud (INS) durante el periodo 2014-2016.

MATERIALES Y MÉTODOS

DISEÑO Y POBLACIÓN DEL ESTUDIO

El presente estudio es una investigación descriptiva transversal. La población estuvo conformada por 297 cepas de Salmonella spp. de origen humano aisladas de heces, sangre y orina. Las cepas fueron remitidas de Lima, Apurímac, Cajamarca, Ancash, Lambayeque y Cuzco al Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del INS, durante el periodo 2014-2016 para la determinación de serovariedades y el estudio de susceptibilidad de antimicrobianos de Salmonella spp.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE Salmonellla Infantis

Las 297 muestras fueron reaisladas en Caldo Tripticasa de Soya (Merck, Germany) a 37 °C durante 6 a 8 horas. Posteriormente, fueron sembradas por agotamiento en placas de Agar Salmonella Shigella (Merck, Germany) y se incubaron a 37 °C durante 18 a 24 horas. El género Salmonella fue confirmado utilizando pruebas bioquímicas convencionales. Estas cepas fueron analizadas con antisueros de aglutinación O y H (Bio Merieux, Francia) siguiendo el esquema de Kauffmann-White 99. Hudzicki J. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol [Internet]. Washington, DC: American Society for Microbiology; 2016. [citado 12 de septiembre de 2018]. Disponible en: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3189, para la identificación de la serovariedad.

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE Salmonella Infantis

Las cepas identificadas por serología como Salmonella Infantis fueron seleccionadas. El ADN de dichas cepas fue extraído utilizando el kit DNesay Blood &Tissue (Qiagen, Germany) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN y la pureza se evaluó mediante un espectrofotómetro (DENOVIX, EEUU). La identificación molecular se realizó mediante Reacción en cadena de Polimerasa (PCR) convencional, teniendo como blanco el gen fljB1010. Kardos G, Farkas T, Antal M, Nógrády N, Kiss I. Novel PCR assay for identification of Salmonella enterica serovar Infantis. Lett Appl Microbiol. 2007;45(4):421-5..

SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

Se evaluó la susceptibilidad a los antimicrobianos de las cepas de Salmonella Infantis, mediante el método de difusión en disco siguiendo los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) 1111. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement (M100-S24) [Internet]. Washington, DC: AACC; 2014. [citado 7 de septiembre de 2018]. Disponible en: https://www.aacc.org/store/books/9200/performance-standards-for-antimicrobial-susceptibility-testing. Los antimicrobianos utilizados fueron: ampicilina, AMP (10 μg), sulfametoxazoltrimetoprima, STX (25 μg), ácido nalidíxico, NAL (30 μg), nitrofurantoina, NIT (300 μg), (10 μg), cefotaxima, CTX (30 μg), ceftazidima, CAZ (30 μg), amoxicilina / ácido clavulánico, AMC (20/10 μg), tetraciclina, TCY (30 μg), cloranfenicol, CHL (30 μg) y ciprofloxacina, CIP (5 μg).

CONFIRMACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE BLEE

Se utilizaron dos métodos para determinar las cepas de Salmonella Infantis productoras de BLEE. Primero, la prueba de sinergia de doble disco (DDST), la cual fue realizada siguiendo el método descrito por Jarlier 1212. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis. 1988;10(4):867-78.. Segundo, la prueba confirmatoria de BLEE-CLSI, la cual fue realizada siguiendo el protocolo de la CLSI 1111. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement (M100-S24) [Internet]. Washington, DC: AACC; 2014. [citado 7 de septiembre de 2018]. Disponible en: https://www.aacc.org/store/books/9200/performance-standards-for-antimicrobial-susceptibility-testing.

SECUENCIAMIENTO Y ANÁLISIS GENÓMICO

Se seleccionaron aleatoriamente cepas de Salmonella Infantis según el perfil fenotípico de resistencia. Las muestras de ADN genómico obtenidas previamente fueron cuantificadas mediante fluorometría (Quibit 3.0 Invitrogen, Malasia). La elaboración de las librerías de secuenciamiento se realizó usando el Kit preparación de librería Nextera XT (Illumina, EEUU), y el secuenciamiento genómico utilizando el secuenciador de nueva generación MiSeq (Illumina, EEUU).

La calidad de las secuencias obtenidas de cada cepa fueron evaluadas mediante el programa Fastqc v0.11.5 1313. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data [Internet]. Cambridge: Babraham Bioinformatics; 2010. Disponible en: http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/. Los adaptadores y bases nitrogenadas de baja calidad fueron removidas usando el programa Trimommatic v0.38 1414. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30(15):2114-20. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/b...
. Se ensamblo de novo las secuencias correspondientes a cada cepa empleando el pipeline a5_pipeline.pl. Se identificó la especie y serotipo de cada cepa usando el programa Multilocus Sequence Typing (MLST) v2.10 1616. Larsen MV, Cosentino S, Rasmussen S, Friis C, Hasman H, Marvig RL, et al. Multilocus sequence typing of totalgenome- sequenced bacteria. J Clin Microbiol. 2012;50(4):1355-61. doi: 10.1128/JCM.06094-11.
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. Se utilizó un genoma de referencia de Salmonella Infantis (Genbank id CP016412 y CP016413) para identificar los contigs del cromosoma y plásmido de cada cepa secuenciada usando el programa Bandage v0.8.11717. Wick RR, Schultz MB, Zobel J, Holt KE. Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics. 2015 ;31(20):3350-2. doi: 10.1093/bioinformatics/btv383
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, basado en el algoritmo BLAST 1818. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3):403-10. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.
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con parámetros de 80% de identidad, 20 pares de base (pb) de cobertura mínima. Para identificar los genes de resistencia se descargó la base de datos CARD 1919. Jia B, Raphenya AR, Alcock B, Waglechner N, Guo P, Tsang KK, et al. CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D566-D573. doi: 10.1093/nar/gkw1004.
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y genes del integrón 1, 2 y 3 2020. Asgharpour F, Rajabnia R, Ferdosi Shahandashti E, Marashi MA, Khalilian M, Moulana Z. Investigation of Class I Integron in Salmonella infantis and Its Association With Drug Resistance. Jundishapur J Microbiol. 2014;7(5):e10019. doi: 10.5812/jjm.10019.
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, y se construyó una base de datos local.

Se realizó la predicción de secuencias codificantes para cada librería usando el programa Prodigal v2.6.3 2121. Hyatt D, Chen G-L, Locascio PF, Land ML, Larimer FW, Hauser LJ. Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification. BMC Bioinformatics. 2010;11:119. doi: 10.1186/1471-2105-11-119.
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. Se identificaron los genes homólogos de las secuencias a partir de los genes del genoma de referencia, con el algoritmo BLAST con <79% de identidad y una cobertura <80% de alineamiento a la referencia. El código empleado para la anotación se encuentra disponible en https://github.com/OrsonMM/Blast-score-ratio for-genomic s. Todas las secuencias obtenidas durante el estudio han sido depositadas en la base de datos del NCBI (GenBank).

CONSIDERACIONES ÉTICAS

El protocolo de estudio fue aprobado por el ComitéInstitucional de Ética en Investigación del INS, además, el INS otorgó la autorización para el uso de muestras biológicas criopreservadas.

RESULTADOS

IDENTIFICACIÓN DE Salmonella Infantis

En el estudio se analizaron 297 cepas de Samonella spp., de las cuales se identificaron un total de 193 cepas (65,0%) como Salmonella Infantis mediante métodos serológicos y microbiológicos. Las cepas fueron confirmadas como Salmonella Infantis mediante ensayos de PCR para la amplificación del gen fljB (Figura 1).

Figura 1
Identificación de Salmonella Infantis mediante la amplificación del gen fljB

PERFIL DE RESISTENCIA ANTIMICROBIANA

A partir de las 193 cepas confirmadas como Salmonella Infantis se identificó 143 (74,1%) productoras de BLEE al ser resistentes a la ampicilina y cefalosporinas de tercera generación mediante métodos fenotípicos (Figura 2). Se encontraron 13 patrones de resistencia fenotípica diferentes (Tabla 1).

Figura 2
A) Sinergia de doble disco (test de Jarlier), se observa una amplificación o distorsión del halo de inhibición de CTX y/o CAZ en la zona de inserción con AMC. B) Método de BLEE -CSLI, se observa una diferencia de 7 mm del halo de inhibición entre CAZ (20mm) y CAZ-CAZ/CLA (27 mm) y una diferencia de 18 mm entre los discos CTX (10mm) y CTX-CTX/CLA (28 mm).

Tabla 1
Frecuencia de patrones de resistencia en aislados de Salmonella Infantis productores betalactamasas de espectro extendido durante el periodo 2014-2016. Los perfiles en negrita fueron los perfiles secuenciados en el presente estudio

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LOS GENOMAS DE Salmonella Infantis

Se seleccionaron un total de 46 cepas Salmonella Infantis de forma aleatoria. A partir del set de datos se obtuvieron en promedio: 3,2 millones de lecturas, 88 contigs, guaninacitocina 52,0%, 46X. El alineamiento con el genoma de referencia permitió identificar y separar los contigs pertenecientes al cromosoma (48Mpb) y los contigs pertenecientes al plásmido (249 - 354 Kpb) para cada una de nuestras muestras.

El análisis de MLST identificó que 42 de las cepas secuenciadas corresponden al sequence type 32 (ST32). Las cuatro cepas restantes no coincidieron con el sequence type (ST) reportados para Salmonella Infantis, al presentar incongruencias para los genes aroC, hisD y purE (Tabla 2).

Tabla 2
Sequence type de Salmonella Infantis usando el programa el programa Multi-locus Sequence Typing (MLST)

Figura 3
Perfil de resistencia fenotípico y genotípico de las 46 cepas de Salmonella Infantis. En el perfil de resistencia fenotípico una caja negra indica la resistencia, la caja de color blanco indica sensibilidad, la caja de color gris claro indica susceptibilidad intermedia; además la resistencia al disco puede estar dado por genes cromosómicos (*) o plasmídicos (**). En el perfil de resistencia genotípico, para plásmido y cromosoma una “X” es presencia del gen(es) y la no presencia en blanco

Mediante la anotación sobre los contigs del plásmido se logró identificar el integrón clase 1 conformada por los genes Int1, aadA1, QaceΔ1 y sul1 y, el integrón clase 2 conformada por los genes Int2 y dfrA1. Además, en los contigs cromosómicos la anotación detectó genes asociados a resistencia contra diversos antimicrobianos. En la Figura 4 se observa la distribución de los genes asociados a la resistencia de los 10 antimicrobianos utilizados en este estudio y de otros cinco grupos de antimicrobianos.

Figura 4
Genes de resistencia antimicrobiana vinculados con los antibióticos estudiados (*) contra Salmonella Infantis mediante secuenciamiento genético de nueva generación. En el perfil de resistencia genotípico una caja negra indica la presencia del gen de resistencia y la caja de color blanco ausencia del gen.

Se compararon los resultados obtenidos por los patrones de resistencia fenotípicos con la caracterización molecular obtenidos por el secuenciamiento. Los resultados, en general, muestran una correlación entre la presencia/ ausencia de los genes y la detección fenotípica de la resistencia. Esta correlación se aprecia gráficamente en la Figura 3. Se evidencia claramente en el caso de CHL donde las 38 cepas que poseen el gen floR son resistentes y las ocho cepas que no poseen el gen floR son sensibles. En el caso de CIP, las 46 cepas poseen el gen gyrA con la mutación D87Y y todas mostraron una sensibilidad disminuida. Sin embargo, se encontró un caso discordante con CAZ, a pesar de que las 46 cepas poseen los genes asociados a su resistencia, sólo seis cepas fueron resistentes, 12 intermedias y 28 sensibles.

DISCUSIÓN

La Salmonella Infantis es un patógeno emergente con multidrogoresistencia reportado en diferentes regiones del mundo 2222. Franco A, Leekitcharoenphon P, Feltrin F, Alba P, Cordaro G, Iurescia M, et al. Emergence of a Clonal Lineage of Multidrug-Resistant ESBL-Producing Salmonella Infantis Transmitted from Broilers and Broiler Meat to Humans in Italy between 2011 and 2014. PLoS One. 2015;10(12):e0144802. doi: 10.1371/journal.pone.0144802.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.014...
. En el ámbito local y regional existen pocos reportes de esta serovariedad. Por lo cual, el presente trabajo ofrece la primera descripción de los perfiles fenotípicos y genéticos de resistencia a los antimicrobianos de cepas Salmonella Infantis remitidas al INS.

En este estudio el 65,0% de las cepas remitidas al INS fueron confirmadas como Salmonella Infantis, esta alta ocurrencia podría estar relacionada con el incremento de casos asociados a esta serovariedad en el país durante los últimos años, tal como se reportó en el 2011 a partir de un grupo reducido de cepas evaluadas 55. Poppe C, Martin LC, Gyles CL, Reid- Smith R, Boerlin P, McEwen SA, et al. Acquisition of resistance to extendedspectrum cephalosporins by Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport and Escherichia coli in the turkey poult intestinal tract. Appl Environ Microbiol. 2005;71(3):1184-92.. Asimismo, se describe por primera vez que el 74,1% de las Salmonellas Infantis corresponden a un perfil multidrogorresistente, agrupándose en 13 patrones diferentes, con resistencia a más de cinco antimicrobianos y la presencia fenotípica de BLEE. El perfil BLEE fue reportado en una cepa de Salmonella Infantis del 2013 aislada de un paciente procedente de Lima 2323. Silva C, Betancor L, García C, Astocondor L, Hinostroza N, Bisio J, et al. Characterization of Salmonella enterica isolates causing bacteremia in Lima, Peru, using multiple typing methods. PLoS One. 2017;12(12):e0189946. doi: 10.1371/journal.pone.0189946.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.018...
. La presencia de cepas productoras de BLEE dentro de esta serovariedad podría explicar el incremento de casos de Salmonella Infantis en las muestras remitidas al INS.

En estudios previos usando genes de MLST se asigna esta serovariedad dentro del genotipo ST32 2424. Pethplerdprao P, Supa-amornkul S, Panvisavas N, Chaturongakul S. Salmonella enterica multilocus sequence typing and its correlation with serotypes. Food Biotechnology. 2017;31(2):73-9. doi: 10.1080/08905436.2017.1301820.
https://doi.org/10.1080/08905436.2017.13...
. Sin embargo, en el presente estudio se identificaron 42 cepas con este patrón; las otras cepas confirmadas serológicamente y molecularmente como Salmonella Infantis presentaron ST no característicos en la base de datos 2525. Urwin R, Maiden MCJ. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology. Trends Microbiol. 2003;11(10):479-87., estas deben ser considerados para la actualización de la base de datos MLST.

Además, el secuenciamiento genómico es también importante para la caracterización de cepas emergentes con relevancia clínica. Utilizando esta metodología se encontró que las 46 cepas estudiadas, presentaban un megaplásmido asociado a la multidrogoresistencia a CHL, SXT, TCY, CAZ y CTX 2626. Aviv G, Tsyba K, Steck N, Salmon-Divon M, Cornelius A, Rahav G, et al. A unique megaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environ Microbiol. 2014;16(4):977-94. doi: 10.1111/1462-2920.12351.
https://doi.org/10.1111/1462-2920.12351...
. La literatura describe que el megaplásmido puede contener los integrones clase 1, 2 y 3 2020. Asgharpour F, Rajabnia R, Ferdosi Shahandashti E, Marashi MA, Khalilian M, Moulana Z. Investigation of Class I Integron in Salmonella infantis and Its Association With Drug Resistance. Jundishapur J Microbiol. 2014;7(5):e10019. doi: 10.5812/jjm.10019.
https://doi.org/10.5812/jjm.10019...
,2727. Asgharpour F, Mahmoud S, Marashi A, Moulana Z. Molecular detection of class 1, 2 and 3 integrons and some antimicrobial resistance genes in Salmonella Infantis isolates. Iran J Microbiol. 2018;10(2):104-110., sin embargo, las cepas incluidas en el estudio presentan el integrón de clase 1 y 2. Estos están formados por genes dfrA1 y sulf1 que dan resistencia a SXT 2727. Asgharpour F, Mahmoud S, Marashi A, Moulana Z. Molecular detection of class 1, 2 and 3 integrons and some antimicrobial resistance genes in Salmonella Infantis isolates. Iran J Microbiol. 2018;10(2):104-110., el gen tetC que da resistencia a TCY 2828. Lynne AM, Rhodes-Clark BS, Bliven K, Zhao S, Foley SL. Antimicrobial Resistance Genes Associated with Salmonella enterica Serovar Newport Isolates from Food Animals. Antimicrob Agents Chemother. 2008 Jan;52(1):353-6. doi: 10.1128/AAC.00842-07.
https://doi.org/10.1128/AAC.00842-07...
, el gen CTX-M-65 que da resistencia a CAZ y CTX 2929. Tate H, Folster JP, Hsu C-H, Chen J, Hoffmann M, Li C, et al. Comparative Analysis of Extended-Spectrum-ß-Lactamase CTX-M-65-Producing Salmonella enterica Serovar Infantis Isolates from Humans, Food Animals, and Retail Chickens in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61(7). pii: e00488-17. doi: 10.1128/AAC.00488-17.
https://doi.org/10.1128/AAC.00488-17...
. Por otro lado, el secuenciamiento genómico permitió detectar genes cromosómicos (Figura 4) vinculados con la resistencia de otros antimicrobianos como NAL, CIP, NIT, AMP 3030. Li L, Dai X, Wang Y, Yang Y, Zhao X, Wang L, et al. RNA-seq-based analysis of drug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium selected in vivo and in vitro. PLoS One. 2017;12(4):e0175234. doi: 10.1371/journal.pone.0175234.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.017...
.

Podemos observar que los perfiles fenotípicos de multidrogoresistencia fueron confirmados con la presencia de los genes encontrados en el megaplásmido y el cromosoma. Tres casos resumen claramente lo expuesto. Primero, el gen floR, asociado a la resistencia a CHL está presente en 38 y ausente en 8 cepas y las mismas cepas mostraron resistencia y sensibilidad fenotípica respectivamente. Segundo, el gen gyrA, asociado a la resistencia a las quinolonas (NAL y CIP) tiene la mutación D87Y para las 46 cepas y todas ellas mostraron resistencia a NAL y sensibilidad disminuida a CIP. Tercero, los genes asociados a la resistencia (plasmídicos y cromosómicos) a CAZ están presentes en las 46 cepas, pero sólo seis mostraron resistencia fenotípica. Esto sugiere que habría otros mecanismos de resistencia asociados a CAZ que aún no están descritos en la literatura.

Los resultados obtenidos podrían esclarecer la ineficacia de los antimicrobianos en el tratamiento para la salmonelosis y contribuir a la generación de evidencia para establecer un nuevo esquema, aplicable a la salud pública en el tratamiento de dicha enfermedad considerando los perfiles de resistencia descritos.

El estudio presenta la limitación de no haber analizado muestras de las 24 regiones de Perú, lo que hubiera mejorado su representatividad. A pesar de ello, las cepas recibidas han permitido detectar la circulación de los genes responsables de la multidrogoresistencia de Salmonella Infantis productoras de BLEE. Además, los recursos económicos con los que se disponía permitieron secuenciar un número limitado de cepas. Pese a estas limitaciones el estudio brinda información sobre un mayor número de cepas que los disponibles actualmente en las bases de datos.

En conclusión, se logró describir los patrones de resistencia en las muestras remitidas al Instituto Nacional de Salud; además, el uso del secuenciamiento permitió identificar genes de resistencia asociados a otros grupos de antimicrobianos que no estaban incluidos en las recomendaciones de la CLSI (11). El secuenciamiento es la herramienta de elección ya que brinda información necesaria para determinar el patrón de resistencia completo, lo que podría servir para trazar una apropiada estrategia de salud pública en Perú.

Agradecimientos

Al Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación Tecnológica (FONDECYT) y al Instituto Nacional de Salud por el apoyo en el financiamiento del proyecto.

  • 1
    Andino A, Hanning I. Salmonella enterica: Survival, Colonization, and Virulence Differences among Serovars. ScientificWorldJournal. 2015;2015:520179. doi: 10.1155/2015/520179.
    » https://doi.org/10.1155/2015/520179
  • 2
    Rodrigue DC, Tauxe RV, Rowe B. International increase in Salmonella enteritidis: a new pandemic? Epidemiol Infect. 1990;105(1):21-7.
  • 3
    Zamudio ML, Meza A, Bailón H, Martinez-Urtaza J, Campos J. Experiencias en la vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el Perú. Rev Peru Med Exp Salud Publica, 2011;28:128-35.
  • 4
    Su L-H, Chiu C-H, Chu C, Ou JT. Antimicrobial resistance in nontyphoid Salmonella serotypes: a global challenge. Clin Infect Dis. 2004;39(4):546-51.
  • 5
    Poppe C, Martin LC, Gyles CL, Reid- Smith R, Boerlin P, McEwen SA, et al. Acquisition of resistance to extendedspectrum cephalosporins by Salmonella enterica subsp. enterica serovar Newport and Escherichia coli in the turkey poult intestinal tract. Appl Environ Microbiol. 2005;71(3):1184-92.
  • 6
    McDermott PF, Tyson GH, Kabera C, Chen Y, Li C, Folster JP, et al. Whole-Genome Sequencing for Detecting Antimicrobial Resistance in Nontyphoidal Salmonella. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(9):5515-20. doi: 10.1128/AAC.01030-16.
    » https://doi.org/10.1128/AAC.01030-16
  • 7
    Ellington MJ, Ekelund O, Aarestrup FM, Canton R, Doumith M, Giske C, et al. The role of whole genome sequencing in antimicrobial susceptibility testing of bacteria: report from the EUCAST Subcommittee. Clin Microbiol Infect. 2017;23(1):2-22. doi: 10.1016/j.cmi.2016.11.012.
    » https://doi.org/10.1016/j.cmi.2016.11.012
  • 8
    Silva C, Betancor L, García C, Astocondor L, Hinostroza N, Bisio J, et al. Characterization of Salmonella enterica isolates causing bacteremia in Lima, Peru, using multiple typing methods. PLoS One. 2017;12(12):e0189946. doi: 10.1371/journal.pone.0189946.
    » https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189946
  • 9
    Hudzicki J. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol [Internet]. Washington, DC: American Society for Microbiology; 2016. [citado 12 de septiembre de 2018]. Disponible en: http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3189
  • 10
    Kardos G, Farkas T, Antal M, Nógrády N, Kiss I. Novel PCR assay for identification of Salmonella enterica serovar Infantis. Lett Appl Microbiol. 2007;45(4):421-5.
  • 11
    Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fourth Informational Supplement (M100-S24) [Internet]. Washington, DC: AACC; 2014. [citado 7 de septiembre de 2018]. Disponible en: https://www.aacc.org/store/books/9200/performance-standards-for-antimicrobial-susceptibility-testing
  • 12
    Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum beta-lactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis. 1988;10(4):867-78.
  • 13
    Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data [Internet]. Cambridge: Babraham Bioinformatics; 2010. Disponible en: http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
  • 14
    Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30(15):2114-20. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.
    » https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
  • 15
    Coil D, Jospin G, Darling AE. A5-miseq: an updated pipeline to assemble microbial genomes from Illumina MiSeq data. Bioinformatics. 2015;31(4):587-9. doi: 10.1093/bioinformatics/btu661.
    » https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu661
  • 16
    Larsen MV, Cosentino S, Rasmussen S, Friis C, Hasman H, Marvig RL, et al. Multilocus sequence typing of totalgenome- sequenced bacteria. J Clin Microbiol. 2012;50(4):1355-61. doi: 10.1128/JCM.06094-11.
    » https://doi.org/10.1128/JCM.06094-11
  • 17
    Wick RR, Schultz MB, Zobel J, Holt KE. Bandage: interactive visualization of de novo genome assemblies. Bioinformatics. 2015 ;31(20):3350-2. doi: 10.1093/bioinformatics/btv383
    » https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv383
  • 18
    Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3):403-10. doi: 10.1016/S0022-2836(05)80360-2.
    » https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2
  • 19
    Jia B, Raphenya AR, Alcock B, Waglechner N, Guo P, Tsang KK, et al. CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D566-D573. doi: 10.1093/nar/gkw1004.
    » https://doi.org/10.1093/nar/gkw1004.
  • 20
    Asgharpour F, Rajabnia R, Ferdosi Shahandashti E, Marashi MA, Khalilian M, Moulana Z. Investigation of Class I Integron in Salmonella infantis and Its Association With Drug Resistance. Jundishapur J Microbiol. 2014;7(5):e10019. doi: 10.5812/jjm.10019.
    » https://doi.org/10.5812/jjm.10019
  • 21
    Hyatt D, Chen G-L, Locascio PF, Land ML, Larimer FW, Hauser LJ. Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification. BMC Bioinformatics. 2010;11:119. doi: 10.1186/1471-2105-11-119.
    » https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-119
  • 22
    Franco A, Leekitcharoenphon P, Feltrin F, Alba P, Cordaro G, Iurescia M, et al. Emergence of a Clonal Lineage of Multidrug-Resistant ESBL-Producing Salmonella Infantis Transmitted from Broilers and Broiler Meat to Humans in Italy between 2011 and 2014. PLoS One. 2015;10(12):e0144802. doi: 10.1371/journal.pone.0144802.
    » https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144802
  • 23
    Silva C, Betancor L, García C, Astocondor L, Hinostroza N, Bisio J, et al. Characterization of Salmonella enterica isolates causing bacteremia in Lima, Peru, using multiple typing methods. PLoS One. 2017;12(12):e0189946. doi: 10.1371/journal.pone.0189946.
    » https://doi.org/10.1371/journal.pone.0189946
  • 24
    Pethplerdprao P, Supa-amornkul S, Panvisavas N, Chaturongakul S. Salmonella enterica multilocus sequence typing and its correlation with serotypes. Food Biotechnology. 2017;31(2):73-9. doi: 10.1080/08905436.2017.1301820.
    » https://doi.org/10.1080/08905436.2017.1301820
  • 25
    Urwin R, Maiden MCJ. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology. Trends Microbiol. 2003;11(10):479-87.
  • 26
    Aviv G, Tsyba K, Steck N, Salmon-Divon M, Cornelius A, Rahav G, et al. A unique megaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environ Microbiol. 2014;16(4):977-94. doi: 10.1111/1462-2920.12351.
    » https://doi.org/10.1111/1462-2920.12351
  • 27
    Asgharpour F, Mahmoud S, Marashi A, Moulana Z. Molecular detection of class 1, 2 and 3 integrons and some antimicrobial resistance genes in Salmonella Infantis isolates. Iran J Microbiol. 2018;10(2):104-110.
  • 28
    Lynne AM, Rhodes-Clark BS, Bliven K, Zhao S, Foley SL. Antimicrobial Resistance Genes Associated with Salmonella enterica Serovar Newport Isolates from Food Animals. Antimicrob Agents Chemother. 2008 Jan;52(1):353-6. doi: 10.1128/AAC.00842-07.
    » https://doi.org/10.1128/AAC.00842-07
  • 29
    Tate H, Folster JP, Hsu C-H, Chen J, Hoffmann M, Li C, et al. Comparative Analysis of Extended-Spectrum-ß-Lactamase CTX-M-65-Producing Salmonella enterica Serovar Infantis Isolates from Humans, Food Animals, and Retail Chickens in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61(7). pii: e00488-17. doi: 10.1128/AAC.00488-17.
    » https://doi.org/10.1128/AAC.00488-17
  • 30
    Li L, Dai X, Wang Y, Yang Y, Zhao X, Wang L, et al. RNA-seq-based analysis of drug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium selected in vivo and in vitro. PLoS One. 2017;12(4):e0175234. doi: 10.1371/journal.pone.0175234.
    » https://doi.org/10.1371/journal.pone.0175234

  • Fuentes de financiamiento
    La investigación fue financiada por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico, Tecnológico y de Innovación Tecnológica (FONDECYT) y por el Instituto Nacional de Salud en el marco del proyecto Epidemiología molecular y genética de la salmonelosis multirresistente, aprobado con RD. N° 191-2016-OGITT-OPE/INS
  • Citar como
    Quino W, Hurtado CV, Escalante-Maldonado O, Flores-León D, Mestanza O, Vences-Rosales F, et al. Multidrogorresistencia de Salmonella Infantis en Perú: un estudio mediante secuenciamiento de nueva generación. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2019;36(1):37-45.doi:10.17843/rpmesp.2019.361.3934

Histórico

  • Recibido
    14 Set 2018
  • Acepto
    30 Ene 2019
  • Publicación en línea
    13 Mayo 2019
  • Publicación em número
    Jan-Mar 2019
Instituto Nacional de Salud Lima - Lima - Peru
E-mail: revmedex@ins.gob.pe