RESUMEN

El objetivo del estudio fue identificar molecularmente cepas de aspergillus aislados de pacientes con aspergilosis invasiva (AI), que fueron tipificadas primariamente como Aspergillus fumigatus sensu lato por métodos fenotípicos convencionales. Se trabajó con 20 cepas de la micoteca de la sección de micología del Instituto de Medicina Tropical "Daniel A. Carrión". Para obtener el ADN fúngico se emplearon las técnicas de choque térmico, tratamiento enzimático y columnas de silica-gel; y se almacenó a -20 ⁰C para conservarlo. En el procedimiento de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se incluyeron primers marcados con fluorocromo, los cuales amplificaron las secuencias específicas de A. fumigatus. La fluorescencia se midió con el termociclador al final de la fase de hibridación de cada ciclo. Se identificó molecularmente que sólo el 50% de las cepas estudiadas pertenecen a la especie Aspergillus fumigatus sensu stricto.

Palabras clave:
Aspergillus fumigatus; Aspergilosis Pulmonar Invasiva; Tipificación Molecular; Perú

ABSTRACT

The objective of the study was to identify molecularly-isolated strains of Aspergillus from patients with invasive aspergillosis (IA); these strains were primarily typed as Aspergillus fumigatus sensu lato by conventional phenotypic methods. We worked with 20 strains from the mycology section of the Institute of Tropical Medicine "Daniel A. Carrión." To obtain the fungal DNA, thermal shock, enzymatic treatment, and silica gel column techniques were used; and it was stored at -20°C to preserve it. The real-time polymerase chain reaction (qPCR) procedure included fluorochrome-labeled primers, which amplified the specific sequences of A. fumigatus. Fluorescence was measured with the thermocycler at the end of the hybridization phase of each cycle. It was molecularly-identified that only 50% of the strains studied belong to the species Aspergillus fumigatus sensu stricto.

Keywords:
Aspergillus fumigatus; Invasive Pulmonary Aspergillosis; Molecular typing; Peru

INTRODUCCIÓN

La aspergilosis invasiva (AI) es causada por varias especies de micromicetos del género Aspergillus, en la mayoría de los casos reportados, el agente etiológico fue Aspergillus fumigatus (1). El diagnóstico de la AI involucra el análisis microbiológico, el cual se efectúa mediante el estudio de las características fenotípicas del micromiceto; de esta manera se identifica a las principales especies de Aspergillus causantes de AI (2). Sin embargo, en los últimos años se ha evidenciado la existencia de cepas resistentes a los antimicóticos y de características moleculares diferentes, en aislamientos considerados morfológicamente como A. fumigatus, lo cual ha puesto en duda la identificación fenotípica convencional, motivando la aplicación de técnicas moleculares, lo que ha conducido a un cambio significativo en la taxonomía de la especie Aspergillus fumigatus.

Actualmente, se considera como Aspergillus fumigatus sensu lato a las especies tipificadas morfológicamente y como Aspergillus fumigatus sensu stricto a las tipificadas mediante estudios moleculares ³3. Hong SB, Kim DH, Park IC, Choi YJ, Shin HD, Samson R. Re-identification of Aspergillus fumigatus sensu lato based on a new concept of species delimitation. Microbiol. 2010;48(5):607-615.. Asimismo, se ha creado la sección Fumigati⁴4. Balajee SA, Gribskov J, Brandt M, Ito J, Fothergill A, Marr KA. Mistaken identity: Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading as Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 2005;43(12):5996-5999.^,55. Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell. 2005;4(3):625-632., que incluye a A. fumigatus, que consta de 25 especies, ocho en estado anomorfo (Aspergillus) y 17 en estado teleomorfo (Neorsartorya) ⁶6. Samson RA, Hong S, Peterson SW, Frisvad JC, Varga J. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya. Stud Mycol. 2007;59:147-203.^,77. Hong SB, Shin HD, Hong J, Frisvad JC, Nielsen PV, Varga J, Samson RA. New taxa of Neosartorya and Aspergillus in Aspergillus section Fumigati. Antonie van Leeuwenhoek. 2008;93(1-2):87-98.. Debido a ello, mediante técnicas moleculares se han diferenciado especies morfológicamente similares a A. fumigatus, creándose nuevas especies como A. lentulus, y A. viridinutans las cuales han sido incluidas en dicha sección.

Aplicando técnicas moleculares, se ha demostrado hasta en 6% que las AI en humanos son causadas por especies del complejo Aspergillus fumigatus sensu lato diferentes a Aspergillus fumigatus sensu stricto⁸8. Balajee SA, Kano R, Baddley JW, Moser SA, Alexander BD. Molecular identification of Aspergillus species collected for the transplant-associated infection surveillance network. J. Clin. Microbiol. 2009;4:3138-141. doi: 10.1128/JCM.00162-06.
https://doi.org/10.1128/JCM.00162-06... . En aislamientos de otras fuentes, los resultados son variados, por ejemplo, de 146 cepas de Aspergillus fumigatus sensu lato aisladas principalmente de humanos, suelo y animales, se comprobó que 140 (95,8%) eran A. fumigatus sensu stricto⁵5. Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell. 2005;4(3):625-632.; en otro estudio en el que se analizaron 17 muestras de suelo se aislaron 23 cepas de aspergillus sección Fumigati y se demostró que sólo nueve (34,13%) eran A. fumigatus sensu stricto⁹9. Giousiano GE, Piontelli E, Fernández MS, Mangiaterra ML, Cattana ME, Kocsubé S, Varga J. Biodiversity of species of Aspergillus Fumigati in semi-desert soils in Argentina. Rev. Argent. Microbol. 2017;247-254.

En las últimas décadas, se ha producido un incremento significativo de AI. Aun cuando han aumentado las opciones terapéuticas, las tasas de mortalidad se mantienen elevadas ¹⁰10. Mellado E, Alcazar-Fuoli L, Garcia- Effron G, Alastruey-Izquierdo A, Cuenca- Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. New resistance mechanisms to azole drugs in Aspergillus fumigatus and emergence of antifungal drugs-resistant A. fumigatus atypical strains. Medical Mycology. 2006;44(Supplement-1):S367-S371.. Diversos estudios, han revelado un incremento de la resistencia de A. fumigatus a los antifúngicos ¹¹11. Howard SJ, Cerar D, Anderson MJ, et al. Frequency and evolution of azole resistance in Aspergillus fumigatus associated with treatment failure. Emerg Infect Dis. 2009;15(7):1068-1076.. Asimismo, las especies de aspergillus de la sección Fumigati han presentado patrones variables de sensibilidad a los antifúngicos que incluyen resistencia intrínseca y sensibilidades reducidas ¹²12. Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, Cuenca-Estrella M, Rodriguez- Tudela JL. Aspergillus section Fumigati: antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(4):1244-1251. Actualmente, no se dispone de estudios sobre la identificación molecular de las especies de aspergillus que vienen afectando a la población peruana, por lo que, no se puede establecer un esquema terapéutico adecuado ni un programa apropiado de control y vigilancia epidemiológica.

El objetivo del presente estudio fue identificar molecularmente cepas de aspergillus aisladas de pacientes con AI, que fueron tipificadas como Aspergillus fumigatus sensu lato por métodos fenotípicos.

EL ESTUDIO

DISEÑO DE ESTUDIO Y POBLACIÓN

Se realizó un estudio descriptivo y observacional. Se trabajó con 20 cepas de Aspergillus fumigatus sensu lato (identificados morfológicamente) de la micoteca de la Sección de Micología del Instituto de Medicina Tropical «Daniel A. Carrión» (IMT/DAC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM); las cepas fueron aisladas de muestras seriadas de esputo (14), de biopsia de tejido pulmonar (4) y de aspirado bronquial (2), de pacientes con diagnóstico clínico de AI procedentes de dos hospitales públicos de Lima (Hospital Nacional Dos de Mayo y Hospital Nacional Daniel Alcides Carrión). El estudio molecular se realizó en el laboratorio de la Sección de Epidemiología Molecular y Genética del IMT/DAC.

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE ASPERGILLUS FUMIGATUS SENSU LATO

Las cepas de A. fumigatus sensu lato fueron estudiadas morfológicamente según la técnica de Klich y Pitt ²2. Klich MA, Pitt JI. A laboratory guide to common Aspergillus species and their teleomorphs. North Ryde, CSIRO Division of Food Processing;1988. pp 1-116. Cada cepa se sembró en dos placas de Petri que contenían agar Czápek con extracto de levadura, se incubaron a 25 ^°C y 37 ^°C durante siete días. Para la identificación macroscópica, se tomó en consideración, el diámetro, el color y el aspecto de la colonia, además, se tomó en cuenta la difusión de pigmento en el medio de cultivo. Para el estudio microscópico, se utilizaron microcultivos coloreados con azul de lactofenol y se tomó en cuenta la disposición de las métulas o fiálides sobre la vesícula, la forma y el diámetro de la vesícula, y la forma y color de los conidios.

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE A. FUMIGATUS SENSU STRICTO POR PCR EN TIEMPO REAL

Las cepas de Aspergillus fumigatus sensu lato fueron reaisladas en agar papa dextrosa, 72 horas antes del procedimiento de extracción de ADN. Se cosecharon conidios e hifas mediante el raspado del micelio (1 cm²), se lavaron con 8 mL de solución salina estéril y se centrifugaron a 3000 g por cinco minutos. Se descartó el sobrenadante y se transfirió 400 uLdel sedimento a tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL y luego se les agregó 360 uL de buffer (buffer AL Qiagen).

Para determinar cuál es el procedimiento más eficiente para obtener ADN, se ensayaron tres métodos: congelación-descongelación, congelación-ebullición (choque térmico) y batido en perlas de vidrio con buffers de lisis. Se demostró que, el método de choque térmico fue el más eficiente; por ello, las muestras se sometieron a dicho método. Primero, fueron congeladas a -70 ^oC por diez minutos y sometidas a ebullición a 100 ^oC por dos minutos, luego se les dejó enfriar. Se les agregó 20 uL de proteinasa K a una concentración de 20 mg/mL (Qiagen) y se les incubó por dos horas a 56 ^oC. La purificación del ADN se realizó con el Mini Kit QIAamp DNA (Qiagen) siguiendo el protocolo establecido. La concentración de ADN fue determinada mediante la medición de la absorción a 260 nm, obteniendo una concentración mínima de 100 ng/mL ¹⁴14. Griffiths LJ, Anyim M, Doffman SR, Wilks M, Millar MR, Agrawal SG. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-time PCR. Journal of Medical microbiology. 2006;55(9):1187-1191..

Para las reacciones de amplificación se utilizaron: Primers PCR: P1 (5’ GAA AGG TCA GGT GTT CGA GTC A-3’) y P2 (5’ CTT GGT TGC GGG TTT AGG GAT T-3’), y sondas: sonda "alta", tRNAFL(5’TTC TTATTTATATGC GGG TTG ATG TAA TAG TAA CA-3’), que contenía un marcador de fluoresceína en la terminación 3’ y sonda «baja», tRNA LC (5`-AGA TGG CTC ATG ACC ATA ATA TTT AGG TGC p), que contenía un marcador LC Red 640 en la terminación 5’. La mezcla de PCR optimizada (20 uL), contenía 1 uL de cada primer a 0,5 uM, 1 uL de cada sonda a 0,15 uM, 5uL de ADN molde, 9 uL de mastermix y 2 uL de agua PCR. Los 45 ciclos de amplificación incluyeron desnaturalización a 95 °C durante diez segundos, hibridación de los primers y sondas a 60 °C durante diez segundos, y extensión a 72 °C durante ocho segundos. Cuando las dos sondas fueron hibridadas a sus primers, la fluorescencia producida fue detectada y medida por el termociclador (PikoReal, Thermo Fisher Scientific) al final de la fase de hibridación de cada ciclo ¹⁶16. Alastruey-Izquierdo A, Alcazar-Fuoli L, Cuenca -Estrella M. Antifungal susceotibility profile of cryptic species of Aspergillus. Mycopathologia. 2014;178:427- 433. doi: 10.1007/s110-46-014-9775-z
https://doi.org/10.1007/s110-46-014-9775... . La amplificación del ADN molde en las reacciones se midió usando el software Pico Real 2.2 del instrumento.

En este método, el valor CQ (ciclo de cuantificación) fue el punto de corte considerado por el equipo, a partir del cual, se consideraron las amplificaciones como positivas ¹⁵15. Rantakokko-Jalava K, Laaksonen S, Issakainen J, Vauras J, Nikoskelainen J, Viljanen MK, et al. Semiquantitative detection by real-time PCR of Aspergillus fumigatus in bronchoalveolar lavage fluids and tissue biopsy specimens from patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical microbiology. 2003;41(9):4304-4311..

RESULTADOS

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE ASPERGILLUS FUMIGATUS SENSU LATO

Macroscópicamente, las 20 cepas sembradas en agar Czápeck con extracto de levadura e incubadas a 25 ^°C, desarrollaron colonias de 35 a 70 mm de diámetro, de color verde azulado a verde grisáceo, con reverso incoloro o amarillo y a 37 ^°C desarrollaron colonias de 50 a 80 mm de diámetro, de color blanco cremosas y en algunos casos de aspecto algodonoso (Figura 1).

Microscópicamente, tanto a 25 ^°C como a 37 ^°C, presentaron las mismas características: cabezas aspergilares uniseriadas, vesículas piriformes con fiálides ocupando dos tercios de la vesícula. Conidios globosos y superficie lisa. Por lo que, el total de cepas corresponderían a Aspergillus fumigatus sensu lato (Figura 2).

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE Aspergillus fumigatus SENSU STRICTO POR PCR EN TIEMPO REAL

Las curvas de amplificación de ADN por PCR en tiempo real (qPCR) muestran de manera exponencial las unidades relativas de fluorescencia (RFU) producidas a medida que avanzan los ciclos del qPCR, hasta llegar a su plateau en el ciclo 45. Cada línea coloreada representa una muestra distinta ya amplificada. Las curvas de fluorescencia obtenidas después del PCR en tiempo real muestran amplificación absoluta, estimada en RFU, consistentes en la mayoría de las muestras. Se considera positiva, cuando una curva está sobre los 42 ciclos. Mediante este procedimiento confirmamos la identificación de Aspergillus fumigatus sensu stricto en diez cepas de un total de 20 identificadas como A. fumigatus por métodos convencionales (Figura 3 y Tabla 1).

Se considera una curva positiva cuando se encuentra sobre los 42 ciclos. Cada línea coloreada representa una especie distinta ya amplificada. Se identificaron diez cepas de Aspergillus fumigatus sensu stricto, de 20 tipificadas como Aspergillus fumigatus sensu lato.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos evidencian las limitaciones de los métodos convencionales de diagnóstico basados en las características morfológicas, utilizando técnicas de cultivo o histológicas para la identificación de Aspergillus fumigatus, aislados de muestras clínicas. En el Perú, han aumentado los casos de AI producidos por A. fumigatus sensu lato resistentes al tratamiento, lo que motivó a utilizar la técnica de qPCR para reidentificar molecularmente las cepas aisladas. Logramos comprobar que sólo el 50% de las cepas evaluadas eran A. fumigatus sensu stricto, porcentaje significativamente discordante con estudios previos, en los cuales reportaron que entre 94% y 97% de las AI en humanos eran causados por Aspergillus fumigatus sensu stricto⁸8. Balajee SA, Kano R, Baddley JW, Moser SA, Alexander BD. Molecular identification of Aspergillus species collected for the transplant-associated infection surveillance network. J. Clin. Microbiol. 2009;4:3138-141. doi: 10.1128/JCM.00162-06.
https://doi.org/10.1128/JCM.00162-06...

9. Giousiano GE, Piontelli E, Fernández MS, Mangiaterra ML, Cattana ME, Kocsubé S, Varga J. Biodiversity of species of Aspergillus Fumigati in semi-desert soils in Argentina. Rev. Argent. Microbol. 2017;247-254

10. Mellado E, Alcazar-Fuoli L, Garcia- Effron G, Alastruey-Izquierdo A, Cuenca- Estrella M, Rodriguez-Tudela JL. New resistance mechanisms to azole drugs in Aspergillus fumigatus and emergence of antifungal drugs-resistant A. fumigatus atypical strains. Medical Mycology. 2006;44(Supplement-1):S367-S371.

11. Howard SJ, Cerar D, Anderson MJ, et al. Frequency and evolution of azole resistance in Aspergillus fumigatus associated with treatment failure. Emerg Infect Dis. 2009;15(7):1068-1076.

12. Alcazar-Fuoli L, Mellado E, Alastruey-Izquierdo A, Cuenca-Estrella M, Rodriguez- Tudela JL. Aspergillus section Fumigati: antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(4):1244-1251

13. Alhambra A, Catalán M, Moragues MD, et al. Isolation of Aspergillus lentulus in Spain from a critically ill patient with chronic obstructive pulmonary disease. Rev Iberoam Micol. 2008;25:246-249.

14. Griffiths LJ, Anyim M, Doffman SR, Wilks M, Millar MR, Agrawal SG. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-time PCR. Journal of Medical microbiology. 2006;55(9):1187-1191.

15. Rantakokko-Jalava K, Laaksonen S, Issakainen J, Vauras J, Nikoskelainen J, Viljanen MK, et al. Semiquantitative detection by real-time PCR of Aspergillus fumigatus in bronchoalveolar lavage fluids and tissue biopsy specimens from patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical microbiology. 2003;41(9):4304-4311.^-1616. Alastruey-Izquierdo A, Alcazar-Fuoli L, Cuenca -Estrella M. Antifungal susceotibility profile of cryptic species of Aspergillus. Mycopathologia. 2014;178:427- 433. doi: 10.1007/s110-46-014-9775-z
https://doi.org/10.1007/s110-46-014-9775... .

Es importante mencionar que, en el ambiente también se encuentran cepas de A. fumigatus de la sección Fumigati que no corresponden a A. fumigatus sensu stricto; en un estudio de146 cepas de A. fumigatus sensu lato aislados de humanos, suelo y animales se determinó que el 4,1% no correspondían a A. fumigatus sensu stricto³3. Hong SB, Kim DH, Park IC, Choi YJ, Shin HD, Samson R. Re-identification of Aspergillus fumigatus sensu lato based on a new concept of species delimitation. Microbiol. 2010;48(5):607-615. y en otro de 23 cepas de aspergillus de la sección Fumigati aisladas del suelo, el 60,8% (14) no eran A. fumigatus sensu stricto⁹9. Giousiano GE, Piontelli E, Fernández MS, Mangiaterra ML, Cattana ME, Kocsubé S, Varga J. Biodiversity of species of Aspergillus Fumigati in semi-desert soils in Argentina. Rev. Argent. Microbol. 2017;247-254_.

La discordancia entre nuestros resultados del estudio fenotípico (A. fumigatus sensu lato) y del molecular (A. fumigatus sensu stricto) se debe a la presencia de cepas de aspergillus del grupo Fumigati que comparten características fenotípicas con A. fumigatus sensu stricto; resultado similar al reportado en estudios previos de AI realizados en otros países ¹⁷17. Guarro J, Kallas EG, Godoy P, Karenina A, Gené J, Stchigel A, et al. Cerebral aspergillosis caused by Neosartorya hiratsukae,Brazil. Emerg Infect Dis. 2002;8(9):989-991.^,1818. Vinh DC, Shea YR, Sugui JA, Parrilla- Castellar ER, Freeman AF, Campbell JW, et al. Invasive aspergillosis due to Neosartorya udagawae. Clin Infect Dis. 2009;49(1):102-111.. Entre las especies erróneamente identificadas como A. fumigatus se encuentran A. lentulus, A. viridinutans, Neorsartorya fischeri, N. pseudofischeri, N. udagawae y N. hiratsukae⁴4. Balajee SA, Gribskov J, Brandt M, Ito J, Fothergill A, Marr KA. Mistaken identity: Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading as Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 2005;43(12):5996-5999.^,55. Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell. 2005;4(3):625-632.^,77. Hong SB, Shin HD, Hong J, Frisvad JC, Nielsen PV, Varga J, Samson RA. New taxa of Neosartorya and Aspergillus in Aspergillus section Fumigati. Antonie van Leeuwenhoek. 2008;93(1-2):87-98.^,1717. Guarro J, Kallas EG, Godoy P, Karenina A, Gené J, Stchigel A, et al. Cerebral aspergillosis caused by Neosartorya hiratsukae,Brazil. Emerg Infect Dis. 2002;8(9):989-991.^,1919. Gerber J, Chomicki J, Brandsberg JW, Jones R, Hammerman KJ. Pulmonary aspergillosis caused by Aspergillus fischeri var. spinosus: report of a case and value of serologic studies. Am. J. Clin. Pathol. 1973;60(6):861-866.. Los resultados obtenidos sugieren que algunas de estas especies estarían involucradas en los casos de AI en el Perú, contribuyendo a explicar la resistencia al tratamiento; y evidenciando la importancia del ambiente en elincremento de los casos.

La obtención de ADN fúngico es un reto en el diagnóstico molecular de las micosis invasivas, por ello, se evaluaron tres métodos ¹⁴14. Griffiths LJ, Anyim M, Doffman SR, Wilks M, Millar MR, Agrawal SG. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-time PCR. Journal of Medical microbiology. 2006;55(9):1187-1191.^,2020. Fredricks DN, Smith C, Meier A. Comparison of six DNA extraction methods for recovery of fungal DNA as assessed by quantitative PCR. Journal of clinical microbiology. 2005;43(10): 5122-5128. y se seleccionó el de congelación-ebullición (choque térmico) ¹³13. Alhambra A, Catalán M, Moragues MD, et al. Isolation of Aspergillus lentulus in Spain from a critically ill patient with chronic obstructive pulmonary disease. Rev Iberoam Micol. 2008;25:246-249.^,1414. Griffiths LJ, Anyim M, Doffman SR, Wilks M, Millar MR, Agrawal SG. Comparison of DNA extraction methods for Aspergillus fumigatus using real-time PCR. Journal of Medical microbiology. 2006;55(9):1187-1191.^,1616. Alastruey-Izquierdo A, Alcazar-Fuoli L, Cuenca -Estrella M. Antifungal susceotibility profile of cryptic species of Aspergillus. Mycopathologia. 2014;178:427- 433. doi: 10.1007/s110-46-014-9775-z
https://doi.org/10.1007/s110-46-014-9775... . La aplicación de este método, el tratamiento enzimático para la extracción de ADN fúngico y la posterior purificación mediante columnas de sílica-gel mostró ser el procedimiento más efectivo, porque permitió obtener mayores concentraciones de ADN. No obstante por limitaciones del laboratorio, no fue posible determinar molecularmente la especie de las cepas «no A. fumigatus sensu stricto» ni evaluar la sensibilidad a los antifúngicos, de todas las cepas estudiadas.

De los resultados obtenidos, se concluye que al efectuarse el estudio molecular de cepas aisladas de casos de AI, identificadas fenotípicamente como Aspergillus fumigatus sensu lato, un elevado porcentaje de las mismas no corresponde a la especie Aspergillus fumigatus sensu stricto. Asimismo, el método de congelación-ebullición (choque térmico) sería el más efectivo para la obtención del ADN fúngico.

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