RESUMEN

El objetivo del estudio fue determinar la influencia del nacimiento por vía vaginal en comparación con el nacimiento por cesárea sobre el contenido de bacterias acidolácticas con características probióticas de los recién nacidos. Se evaluaron muestras de meconio de recién nacidos por vía vaginal y por cesárea que fueron debidamente enriquecidas, sembradas e incubadas. Las colonias resultantes fueron identificadas para ser sometidas a tolerancia de sales biliares, pH ácido y fermentación. Se obtuvo un mayor desa rrollo de colonias en meconio de nacidos por vía vaginal en comparación con los nacidos por cesárea (p<0,001). Se aislaron 48 cepas en total, siendo en su gran mayoría tolerantes a sales biliares y pH ácido; asimismo, la fermentación de lactosa en leche fue positiva. Este estudio respalda hallazgos previos que sustentan que el nacimiento por vía vaginal favorece al mayor, desarrollo de bacterias acidolácticas con características probióticas, en comparación con el nacimiento por cesárea, y destaca la presencia de bac terias del género Lactobacillus.

Palabras claves:
Microbiota; Neonato; Parto Normal; Cesárea

ABSTRACT

The study’s objective was to determine the influence of vaginal birth compared to cesarean birth on the content of lactic acid bacteria with probiotic characteristics from newborns. Vaginal and cesarean sec tion meconium samples of lactic acid were evaluated, which were duly enriched, seeded and incubated. The resulting colonies were identified to be subjected to bile salt tolerance, acid pH, and fermentation. A greater development of meconium colonies was obtained in those born vaginally compared to those born by caesarean section (p <0.001). A total of 48 strains were isolated, the majority being tolerant to bile salts and acid pH; likewise, the fermentation of lactose in milk was positive. This study supports previous findings that support vaginal birth favors the greatest development of lactic acid bacteria with probiotic characteristics, compared to cesarean birth, and highlights the presence of bacteria of the genus Lactobacillus.

Keywords:
Microbiota; Newborn; Natural Childbirth; Cesarean Section

INTRODUCCIÓN

Las bacterias acidolácticas poseen efectos benéficos en la prevención y en el tratamiento de enfermedades, especialmente en infantes y niños. Las investigaciones han demostrado la presencia de bacterias en el meconio y en la sangre del cordón umbili cal de neonatos sanos ¹1. Harmsen HJM, Wildeboer-Veloo ACM, Raangs GC, Wagendorp AA, Klein N, Bondels JG, et al. Analysis of intestinal flora development in breast-fed infants by using molecular identification and detection methods. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2000;30(1):61-7., y que incluso los fetos a término no son microbiológicamente estériles ²2. Jiménez EA. Fuentes de bacterias para la colonización del intestino del neonato: aplicación para el tratamiento de la mastitis lactacionales. [Tesis Doctoral]. Madrid: Universidad Complutense de Madrid; 2010 [citado el 20 de junio de 2017]. Disponible en https://eprints.ucm.es/10063/1/T31541.pdf.. La influencia en el conteni do de la microbiota intestinal se da en gran medida en el nacimiento y depende del tipo de parto (vía vaginal o cesárea), del tipo de alimentación (leche materna o leche maternizada) e, incluso, del contacto íntimo que se establece entre la madre y el hijo.

Los géneros pertenecientes a la microbiota natural del intestino corresponden a Lactobacillus y Bifidobacterium, que se desa rrollan de forma diferenciada según el tipo de parto. Se ha reportado la presencia de estas bacterias en el meconio de recién naci dos vía vaginal a los 10 días de vida; y posterior a los 30 días de vida en recién nacidos por cesárea ³3. Grönlund MM, Lehtonen OP, Ferola E, Kero P. Fecal microflora in healthy infants born by different methods of delivery: permanent changes in intestinal flora after cesarean delivery. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1999;28(1):19-25.. Además, la colonización por lactobacilos en nacidos por vía vaginal se da en mayor proporción (59%), en comparación con lo que sucede con los nacidos por cesárea (4%), estos últimos son colonizados más a menudo por Clostridium difficile, bacteria que normalmente se encuentra en el sistema digestivo de personas hospitalizadas o que se encuentran en tratamiento con antibióticos ⁴4. Mitsou EK, Kirtzalidou E, Oikonomou I, Liosis G, Kyriacou A. Fecal microflora of Greek healthy neonates. Anaerobe. 2008;14(2):94-101. doi: 10.1016/j.anaerobe.2007.11.002.
https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2007.... .

Durante el parto por cesárea se interrumpe la transmisión de bacterias de la madre al recién nacido, lo que ocurre normal mente a través de la vía vaginal, esto conlleva a un incremento de enfermedades como: enfermedad celíaca ⁵5. Marild K, Stephansson O, Montgomery S, Murray JA, Ludvigsson JF. Pregnancy outcome and risk of celiac disease in offspring: a nationwide case-control study. Gastroenterology. 2012;142:39-45. doi: 10.1053/j.gastro.2011.09.047.
https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.09... , diabetes tipo 1 ⁶6. Aumeunier A, Grela F, Ramadan A, Pham Van L, Bardel E, Gomez Alcala A, et al. Systemic Toll-like receptor stimulation suppresses experimental allergic asthma and autoimmune diabetes in NOD mice. PLoS ONE. 2010;5(7):e11484. doi: 10.1371/journal.pone.0011484.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.001... ⁾ y obesidad ⁷7. Blustein J, Attina T, Liu M, Ryan AM, Cox LM, Blaser MJ, et al. Association of caesarean delivery with child adiposity from age 6 weeks to 15 years. Int J Obes (Lond). 2013;37(7):900-6. doi: 10.1038/ijo.2013.49.
https://doi.org/10.1038/ijo.2013.49... . En el Perú, el Ministerio de Salud reportó que en el 2015 los nacimientos por cesárea alcanzaron un porcentaje de 34,5%, y que nueve regiones tuvieron valores por encima del promedio, entre las que destacan Tumbes (49,8%), Tacna (47,2%) y Lima (42,8%).

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar si el tipo de nacimiento, vía vaginal o cesárea, influye en el contenido de bacterias acidolácticas con potencial probiótico, provenientes del meconio de neonatos humanos.

EL ESTUDIO

Recolección de muestras

Realizamos un estudio observacional analítico. Durante cuatro meses se extrajeron al azar 60 muestras de meconio de neonatos humanos de cero a tres días de vida, del Instituto Nacional Materno Perinatal (INMP) de Lima, 30 muestras correspondían a partos por vía vaginal y 30 a cesárea. Se consideraron 30 muestras por cada grupo de neonatos debido a que el promedio de na cimiento por día en el INMP es de 60.

Aislamiento de bacterias

Para el preenriquecimiento se adicionaron 18 ml de caldo Man Rogosa Sharp (MRS) (Merck, Alemania) sobre 2 g de meconio en frascos estériles, que fueron incubados a 37 ºC por 24 horas ⁸8. Moreno R, Salas EJ, Pérez CI, Jiménez J. Evaluación del potencial probiótico de Lactobacilos aislado de heces de lactantes y leche materna. Rev Fac Med ULA. 2011;20(1):135-9.⁾ en un laboratorio clínico particular. Seguidamente, las mue stras fueron sembradas por duplicado en placas de agar MRS para bacterias acidolácticas (Merck, Alemania) ajustadas a pH 5,5 e incubadas a 37 °C por 24 a 48 horas en microaerobiosis. Después, las muestras fueron sometidas a tinción de Gram, detección de esporas y prueba de catalasa para bacilos grampositivos libres de espora; además, se realizó el conteo de colonias blancas y cremosas considerando las características correspondientes de color, tamaño, forma y aspecto ⁹9. Kandler O, Weiss G. Regular nonsporing Gram positives rods. En: Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG, editors. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 2. Baltimore: Maryland; 1986. pp. 1208-60.. Posteriormente, se seleccio naron dos colonias de bacterias grampositivas no esporuladas y catalasa negativa ¹⁰10. Mejía-Rodríguez JA, Chacón-Rueda Z, Guerrero-Cárdenas B, Ottoniel-Rojas J, López-Corcuera G. Obtención de cepas de Lactobacillus: Caracterización in vitro como posible potencial probiótico. Rev Cientif. 2007;17(2):178-85., que fueron aisladas en agar MRS y MRS modificado e incubadas a 37 °C entre 24 y 48 horas en microaerobiosis. Seguidamente, las cepas aisladas fueron inoculadas en tubos de caldo MRS e incubadas a 37 °C por 24 horas, para después ser centrifugadas a 8000 g por cinco minutos. Finalmente, se extrajo el sobrenadante y se añadió 1 ml de caldo MRS y 40% de glicerol para su almacenamiento a -80 °C.

Tolerancia a sales biliares

La prueba se realizó en el Laboratorio de Microbiología y Biotecnología de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacio nal Agraria la Molina (UNALM)). Se utilizó 0,5 ml de inóculo activado por 18 horas en caldo MRS que fueron adicionados a tubos que contenían 0,3% de sales biliares de origen bovino (Sigma, New Zealand) y 4,5 ml de caldo MRS; lo cual se incubó a 37 °C por 24 horas ¹¹11. Lara C, Burgos A. Potencial probiótico de cepas nativas para uso como aditivos en la alimentación avícola. Rev Colomb Biotecnol. 2012;14(1):31-40.. Las muestras fueron leídas en un espectrofotómetro a 600 nm (Thermo Scientific, modelo Genesys 10S UV-VIS), y los resultados, expresados como densidad óptica. Además, se calculó el porcentaje de sobrevivencia (R) mediante la relación entre log UFC/ml de muestra con sales biliares y el log UFC/ml de muestra sin sales biliares ¹²12. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Luce C. Cepas de Lactobacillus spp. Con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;37(2):94-104..

Tolerancia al pH ácido

Se añadió 0,5 ml de inóculo a tubos en alícuotas de 4,5 ml de caldo MRS a pH 3,0 acidificado con HCl 6M ¹¹11. Lara C, Burgos A. Potencial probiótico de cepas nativas para uso como aditivos en la alimentación avícola. Rev Colomb Biotecnol. 2012;14(1):31-40.. Estas muestras fueron activadas durante 18 horas en caldo MRS e incubadas a 37 °C por 24 horas para medir la resistencia por densidad óptica a 600 nm (Thermo Cientific, modelo Genesys 10S UV-VIS), para finalmente calcular R respecto a la referencia ¹²12. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Luce C. Cepas de Lactobacillus spp. Con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;37(2):94-104..

Prueba de fermentación de lactosa de la leche

La prueba consistió en inocular 3% de las cepas en 20 ml de leche pasteurizada (3/100v) que fueron incubadas a 37 °C por 18 horas, para finalmente medir el pH final ¹²12. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Luce C. Cepas de Lactobacillus spp. Con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;37(2):94-104.. Esta prueba se realizó en el Laboratorio de Ecología Microbiana y Biotecnología de la Facultad de Ciencias de la UNALM.

Análisis estadístico

Los datos registrados para determinar la presencia de bacterias acidolácticas en el meconio de los recien nacidos por vía va ginal y por cesárea fueron analizados por duplicado. Para evaluar la normalidad se utilizó la prueba de Kolmogórov-Smirnov. Para evaluar las diferencias en el promedio de colonias según el tipo de parto, se usó la prueba U de Mann Whitney mediante el programa SPSS v. 20. Mientras que para analizar las pruebas de resistencia al pH ácido y a las sales biliares, se usó la prueba T de Student mediante el programa estadístico R versión 3.4.0.

Consideraciones éticas

El estudio tuvo la aprobación del Comité de Ética de Investigación del INMP. El propósito de la investigación fue explicado a las madres de los neonatos, quienes brindaron el consentimiento para extraer las muestras.

HALLAZGOS

Recolección de muestras

Las muestras de meconio de los nacidos por cesárea fueron de color amarillo verdoso, mientras que las muestras de meconio de los nacidos por vía vaginal tuvieron coloración negro verdoso (Figura 1). Durante la recolección de meconio, se tuvo diferencias en las muestras de dos neonatos nacidos por cesárea, los cuales correspondían a neonatos de tres días de vida; el resto de muestras correspondía a neonatos de un día de vida. Asimismo, 28 de los neonatos nacidos por cesárea fueron alimentados con fórmula arti ficial y dos de ellos con leche materna a partir del tercer día de vida; mientras que aquellos nacidos por vía vaginal tuvieron lactancia materna exclusiva.

Aislamiento de bacterias

En la etapa de preenriquecimiento, dos muestras de meconio de recién nacidos por cesárea formaron gases que desprendían olores desagradables, las cuales se procedieron a sembrar en medio MacConkey. Luego de la incubación, se confirmó la pre sencia de colonias de enterobacterias.

En la prueba de crecimiento en placa, 28 de 30 muestras de meconio de recién nacidos por vía vaginal presentaron creci miento de colonias de bacterias acidolácticas (93,3%) comparado con dos de 30 muestras de meconio de los nacidos por ce sárea (6,7%) (Figura 2). Asimismo, el promedio de colonias fue mayor en el meconio de los nacidos por vía vaginal (p<0,001) (Tabla 1). Estas colonias fueron observadas al microscopio, y se encontraron bacilos largos delgados y bacilos cortos, que corresponden a características de bacterias acidolácticas ⁹9. Kandler O, Weiss G. Regular nonsporing Gram positives rods. En: Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG, editors. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 2. Baltimore: Maryland; 1986. pp. 1208-60.. Se lograron aislar, en total, 48 colonias que se sembraron en medio MRS modificado, y se observó una mejor diferenciación de las colonias según su tamaño, color y borde (Figura 3).

Tolerancia a sales biliares y al pH ácido

Se aislaron 48 cepas de bacterias acidolácticas que fueron sometidas a una tolerancia >30% de sobrevivencia para un lapso de 24 horas a un pH ácido de 3,0, y >20% de sobrevivencia para una concentración de 0,3% de sales biliares. Se obtuvo un total de 33 (68,7%) cepas sobrevivientes con mayor resistencia al ácido que a las sales biliares, medidos por absorbancia.

Prueba de fermentación en leche

Todas las cepas aisladas fermentaron la lactosa de la leche, obteniéndose un pH promedio de 3,95±0,22 (3,71≤ pH ≥ 4,71).

DISCUSIÓN

Se evidenció que el meconio de recién nacidos por vía vaginal posee mayor presencia de bacterias acidolácticas que el meconio de recién nacidos por cesárea, y escasa presencia de organismos anaerobios.

El crecimiento de bacterias acidolácticas en las muestras de meconio de recién nacidos por vía vaginal está relacionada con la mayor cantidad de lactobacilos que presenta la vagina de la mujer y que, durante el parto, se transmite y coloniza la mucosa del tracto digestivo, respiratorio, urogenital y piel del neonato ¹³13. Gritz EC, Bhandari V. The Human Neonatal Gut Microbiome: A Brief Review. Front Pediatr. 2015;3:17. doi: 10.3389/fped.2015.00017.
https://doi.org/10.3389/fped.2015.00017... . La colonización intestinal se da especialmente por el género Lactobacillus, lo cual contribuye a la formación de la microbiota en los neonatos ¹⁴14. Biasucci G, Rubini M, Riboni S, Morelli L, Bessi E, Retetangos C. Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut. Early Hum Dev. 2010;86(1):13-5. doi: 10.1016/j.earlhumdev.2010.01.004.
https://doi.org/10.1016/j.earlhumdev.201... ^-1515. Madan JC, Salari RC, Saxena D, Davidson L, O'Toole GA, Moore JH, et al. La colonización microbiana del intestino en neonatos prematuros predice la sepsis neonatal. Arch Dis Child Fetal and Neonatal Edition. 2012;97(6):F456-62.. Por lo tanto, consideramos que el mayor crecimiento de bacterias acidolácticas en el meconio de recién nacidos por vía vaginal se debió al aporte de la madre al pasar a través del canal del parto y a la lactancia exclusiva que recibieron.

Por el contrario, el meconio de recién nacidos por cesárea evidenció una mayor presencia de enterobacterias, lo cual estaría directamente relacionado con la presencia de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Propiobacterium y Corynebacterium en el tracto digestivo de estos neonatos ¹⁴14. Biasucci G, Rubini M, Riboni S, Morelli L, Bessi E, Retetangos C. Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut. Early Hum Dev. 2010;86(1):13-5. doi: 10.1016/j.earlhumdev.2010.01.004.
https://doi.org/10.1016/j.earlhumdev.201... ^-1515. Madan JC, Salari RC, Saxena D, Davidson L, O'Toole GA, Moore JH, et al. La colonización microbiana del intestino en neonatos prematuros predice la sepsis neonatal. Arch Dis Child Fetal and Neonatal Edition. 2012;97(6):F456-62.. Además, las investigaciones recientes señalan que los nacidos por cesárea carecerían de colonización intestinal, o que esta se presentaría tardíamente, incluso hasta un año de edad ¹⁶16. Jakobsson HE, Abrahamsson TR, Jenmalm MC, Harris K, Quince C, Jernberg C. Decreased gut microbiota diversity, delayed Bacteroidetes colonisation and reduced Th1 responses in infants delivered by caesarean section. Gut. 2014;63(4):559-66. doi: 10.1136/gutjnl-2012-303249.
https://doi.org/10.1136/gutjnl-2012-3032... . Por lo que, el bajo crecimiento de bacterias acidolácticas en el meconio de recién nacidos por cesárea (6,7%) estaría relacionado con el poco consumo de leche ma terna al tercer día de vida, ya que se ha reportado la presencia de bacterias lácticas (Lactobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Bifidobacterium) en la leche materna, que es transmitida al neonato al ser amamantado ¹⁷17. Solís G, De los Reyes-Gavilan CG, Fernández N, Margolles A, Gueimonde M. Establishment and development of lactic acid bacteria and bifidobacteria microbiota in breast-milk and the infant gut. Anaerobe. 2010;16(3):307-10. doi: 10.1016/j.anaerobe.2010.02.004.
https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.... .

El color amarillo verdoso y el olor intenso característico de las heces de los recién nacidos por cesárea, presumiblemente sea por la alimentación con leche de fórmula, a diferencia de lo observado en los recién nacidos por vía vaginal que se alimentaron primor dialmente con leche materna ¹³13. Gritz EC, Bhandari V. The Human Neonatal Gut Microbiome: A Brief Review. Front Pediatr. 2015;3:17. doi: 10.3389/fped.2015.00017.
https://doi.org/10.3389/fped.2015.00017... .

Las características descritas de las colonias de color blanco contabilizadas y seleccionadas en medio sólido corresponden a la descripción de bacterias acidolácticas del género Lactobacillus⁹9. Kandler O, Weiss G. Regular nonsporing Gram positives rods. En: Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt JG, editors. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol 2. Baltimore: Maryland; 1986. pp. 1208-60. y, al crecer en caldo MRS presentaron precipitación rápida de células de color blanco al fondo del tubo, lo que ocurre cuando el crecimiento culmina dando lugar a un sedimento suave y homogéneo ¹⁸18. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. Bergey´s Manual of Determinative and Bacterology 9a ed. Washington: National Academy Press; 2001..

Del total de cepas aisladas de bacterias acidolácticas el 68,7% presentó resistencia a las condiciones gastrointestinales durante un tiempo de exposición de 24 horas medidos por absorbancia, este valor es menor al 73,3% reportado para Lactobacillus ramosus expuesto por dos horas ¹⁹19. Rodríguez Gonzáles M. Aislamiento y selección de cepas del género Lactobacillus con capacidad probiótica e inmunomoduladora. [Tesis Doctoral]. Barcelona: Universidad de Barcelona; 2009 [citado 20 enero 2019]. Disponible en: https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/3931/mrg1de1.pdf.
https://www.tdx.cat/bitstream/handle/108... , la diferencia podría estar relacionada con el tiempo de exposición. Es probable que las cepas sobrevi vientes fuesen Lactobacillus casei (ATCC 27139, FAGRO 98, FAGRO 98LP) y Lactobacillus rhamnosus (FAGRO 36.5), ya que se ha reportado su resistencia al pH ácido y a altas concentraciones de sales biliares, que incluso sobreviven en el tracto gastrointestinal ²⁰20. León Reissig MF. Evaluación in vitro de cepas de bacterias acidolácticas nativas con potencial probiótico. [Tesis de Licenciatura]. Montevideo: Universidad de la Republica; 2012. [citado 12 marzo 2019]. Disponible en: https://www.colibri.udelar.edu.uy/jspui/handle/20.500.12008/1432.
https://www.colibri.udelar.edu.uy/jspui/... .

Todas las bacterias acidolácticas aisladas fermentaron la lactosa de leche y el pH promedio registrado fue de 3,95, el cual se encuentra dentro del rango de Lactobacillus spp. ¹²12. Sánchez L, Omura M, Lucas A, Pérez T, Llanes M, Luce C. Cepas de Lactobacillus spp. Con capacidades probióticas aisladas del tracto intestinal de terneros neonatos. Rev Salud Anim. 2015;37(2):94-104..

Entre las limitaciones es preciso mencionar que la extracción de muestras fue limitada a dos a tres por semana, por cada grupo evaluado. El intervalo de tiempo entre la obtención de cada muestra dependía de la defecación del neonato, lo que influía en su traslado al laboratorio para los análisis correspondientes. Sin embargo, una vez colectada, se la mantenía en condiciones adecuadas para evitar su contaminación y deterioro.

Finalmente, se puede concluir que el meconio de recién nacidos por vía vaginal presentó un mayor desarrollo de bacterias acidolác ticas con una mayor presencia de bacterias del género Lactobacillus en comparación a los nacidos por cesárea, en quienes se evidenció la presencia de enterobacterias.

Agradecimientos:

A la Dra. Luz Veliz Sedano y a la Dra. Aida Cordero por sus valiosos aportes al desarrollo del presente trabajo de investigación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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