RESUMEN

Se caracterizó la resistencia antimicrobiana de 70 aislados de Escherichia coli obtenidos de pacientes con infección del tracto urinario (ITU) provenientes de ocho hospitales públicos en el Perú. Los perfiles de resistencia fueron identificados mediante el uso del sistema automatizado MicroScan®. Se utilizó una reacción en cadena de la polimerasa convencional para la detección de los genes bla _TEM, bla _CTX-M, bla _SHV y bla _PER. El 65,7% (46/70) de los aislados presentó un fenotipo multidrogorresistente y el 55,7% (39/70) fue identificado como productores de betalactamasas de espectro extendido. Se detectaron altos niveles de resistencia para ampicilina (77,1%), ciprofloxacina (74,3%), trimetoprim/sulfametoxazol (62,9%), cefepime (57,1%) y cefuroxima (57,1%). El gen bla _TEM fue el más frecuente con un 31,4%, seguido por bla _CTX-M (18,6%) y bla _SHV (2,9%). Los resultados evidencian altos niveles de resistencia a antimicrobianos de importancia clínica en aislados de E. coli de pacientes con ITU en el Perú.

Palabras clave:
Escherichia coli; Farmacorresistencia Bacteriana; Resistencia betalactámica; Enfermedades Urológicas; Perú

INTRODUCCIÓN

Las infecciones del tracto urinario (ITU) tienen una alta incidencia en todo el mundo, y ocasionan elevados costos de tratamiento para los sistemas de salud ¹1. Stamm WE, Norrby SR. Urinary tract infections: disease panorama and challenges. J Infect Dis. 2001;183 Suppl 1: S1-4. doi:10.1086/318850.
https://doi.org/10.1086/318850... . Escherichia coli es el agente etiológico encontrado con mayor frecuencia en las ITU y el tratamiento se basa en antimicrobianos. Sin embargo, la falta de regulación de estos tratamientos favoreció la aparición de cepas multidrogorresistentes (MDR) en todo el mundo ²2. Pitout JD. Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli: A Combination of Virulence with Antibiotic Resistance. Front Microbiol. 2012;3:9. doi: 10.3389/fmicb.2012.00009.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00009... ⁾ y la emergencia de cepas de E. coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) con la capacidad de hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y monobactams. Los genes que codifican la producción de BLEE se encuentran frecuentemente en plásmidos y usualmente van acompañados de otros genes de resistencia a cefalosporinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas y aminoglucósidos ³3. Lee SY, Kotapati S, Kuti JL, Nightingale CH, Nicolau DP. Impact of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species on clinical outcomes and hospital costs: a matched cohort study. Infect Control Hosp Epidemiol. 2006;27(11):1226-32. doi: 10.1086/507962.
https://doi.org/10.1086/507962... . Existen diversos genes codificantes para BLEE, siendo más frecuentes los de las familias TEM, SHV y CTX-M ⁴4. D'Andrea MM, Arena F, Pallecchi L, Rossolini GM. CTX-M-type ß-lactamases: a successful story of antibiotic resistance. Int J Med Microbiol. 2013;303(6-7):305-17. doi: 10.1016/j.ijmm.2013.02.008.
https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2013.02.0... ^,55. Pitout JD, Hossain A, Hanson ND. Phenotypic and molecular detection of CTX-M-beta-lactamases produced by Escherichia coli and Klebsiella spp. J Clin Microbiol. 2004;42(12):5715-21. doi: 10.1128/JCM.42.12.5715-5721.2004.
https://doi.org/10.1128/JCM.42.12.5715-5... . Más de 400 tipos de estas enzimas han sido reportadas y las CTX-M son las de mayor frecuencia en todo el mundo ⁶6. Woerther PL, Burdet C, Chachaty E, Andremont A. Trends in human fecal carriage of extended-spectrum ß-lactamases in the community: toward the globalization of CTX-M. Clin Microbiol Rev. 2013;26(4):744-58. doi: 10.1128/CMR.00023-13.
https://doi.org/10.1128/CMR.00023-13... .

En el Perú, la detección de resistencia antimicrobiana en bacterias causantes de ITU no está incluida en el sistema de vigilancia epidemiológica y no se cuenta con datos actualizados ⁷7. Astete S, Madrid L, Fukuda F, Buckley A, Meritens D, Menchola JV. Sensibilidad antibiótica de los gérmenes causantes de infecciones urinarias en pacientes ambulatorios en el Hospital Nacional Arzobispo Loayza. Rev Soc Per Med Inter. 2004;17(1): 5-8.. Conocer los niveles de resistencia y genes asociados a la producción de BLEE en aislados de E. coli de ITU permitirá establecer terapias empíricas efectivas y programas de control. Por ello, el objetivo del estudio fue caracterizar mediante pruebas fenotípicas y moleculares la resistencia antimicrobiana y prevalencia de BLEE en aislados de E. coli de pacientes con ITU provenientes de ocho hospitales públicos de diferentes departamentos del Perú.

EL ESTUDIO

Se realizó un estudio descriptivo, basado en la obtención de aislados bacterianos de ocho hospitales públicos localizados en los departamentos de Cusco, Huancavelica, La Libertad, Loreto, Madre de Dios, Puno, San Martín y Tumbes. Se utilizó un total de 70 aislados de E. coli obtenidos de pacientes ambulatorios con diagnóstico clínico compatible con ITU recolectados durante el 2018.

Los aislados fueron caracterizados en el Laboratorio de Investigación en Biología Molecular de la Universidad Peruana Unión. La confirmación de especie y determinación de perfiles de resistencia se llevó a cabo mediante el uso del sistema automatizado MicroScan® (AutoScan-4) y el uso de paneles para gramnegativos (Dade MicroScan®) siguiendo indicaciones del fabricante. Se incluyeron 15 antimicrobianos correspondientes a diferentes familias: ampicilina (AMP), ampicilina con sulbactam (AMP/SUL), amoxicilina con ácido clavulánico (AMC), piperacilina con tazobactam (PIP/TZ), aztreonam (ATM), cefepime (FEP), cefuroxima (CFX), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (FOX), tobramicina (TOB), gentamicina (GEN), ciprofloxacina (CIP), trimetoprim/sulfametoxazol (SXT), colistina (COL) y tigeciclina (TIG). Adicionalmente, se detectó la presencia de E. coli productores de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). Los resultados fueron interpretados según recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, sus siglas en inglés) ⁸8. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing [Internet]. 30th ed; 2020 [citado el 12 de febrero de 2020]; Disponible en: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/.
https://clsi.org/standards/products/micr... .

La extracción de ADN se realizó por medio del kit innuPREP siguiendo instrucciones del fabricante (Analytik Jena, Alemania). Para la identificación de genes, se utilizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional diseñada para cada gen bla _CTX-M⁹9. Edelstein M, Pimkin M, Palagin I, Edelstein I, Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(12):3724-32. doi: 10.1128/aac.47.12.3724-3732.2003.
https://doi.org/10.1128/aac.47.12.3724-3... , bla _TEM¹⁰10. Arlet G, Philippon A. Construction by polymerase chain reaction and intragenic DNA probes for three main types of transferable Î2-lactamases (TEM, SHV, CARB). FEMS Microbiol Lett. 1991;68(1):125. doi:10.1111/j.1574-6968.1991.tb04833.x.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1991... , bla _SHV¹¹11. Essack SY, Hall LM, Pillay DG, McFadyen ML, Livermore DM. Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrum beta-lactamases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban, South Africa. Antimicrob Agents Chemother. 2001;45(1):88-95. doi: 10.1128/AAC.45.1.88-95.2001.
https://doi.org/10.1128/AAC.45.1.88-95.2... y bla _PER¹²12. Kiratisin P, Apisarnthanarak A, Laesripa C, Saifon P. Molecular characterization and epidemiology of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates causing health care-associated infection in Thailand, where the CTX-M family is endemic. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(8):2818-24. doi: 10.1128/AAC.00171-08.
https://doi.org/10.1128/AAC.00171-08... . Las secuencias de cebadores utilizados son detalladas en la Tabla 1.

La multidrogorresistencia fue definida según la detección de un fenotipo resistente para al menos un antimicrobiano en tres o más clases. La proporción de aislados resistentes fue estratificada según sexo del paciente. El análisis bivariado se desarrolló mediante el uso de la prueba exacta de Fisher con un nivel de confianza del 95%. El manejo de datos se realizó con el uso del paquete estadístico Stata 16 (StataCorp, College Station, Texas, EE. UU.).

El estudio fue evaluado y aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Peruana Unión (N2019-CEUPeU-0001) y por la Dirección Universitaria de Investigación, Ciencia y Tecnología de la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

HALLAZGOS

Se obtuvieron 70 aislados de Escherichia coli provenientes de pacientes ambulatorios con diagnóstico compatible con una infección del tracto urinario (UTI) provenientes de hospitales públicos en Huancavelica (n=15), Loreto (n=14), Tumbes (n=13), Madre de Dios (n=12), La Libertad (n=8), Puno (n=4), Cusco (n=3) y San Martín (n=1). La media de edad fue 38,8 años y el 80% (n=56) fueron pacientes femeninos. El 65,7% de los aislados (46/70) presentó un fenotipo multidrogorresistente (MDR), siendo más frecuente en pacientes de sexo masculino (78,6%, 11/14) en comparación a los femeninos (62,5%, 35/56). El 55,7% (39/70) de los aislados fueron identificados como productores de betalactamasas de espectro extendido (BLEE), con una mayor frecuencia en pacientes de sexo masculino (64,3%, 9/14) en comparación con los femeninos (53,6%, 30/56). Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0,05). El 92,3% (36/39) de los aislados identificados como productores de BLEE, presentó un fenotipo MDR incluyendo resistencia a aminoglucósidos, fluoroquinolonas, betalactámicos y sulfonamidas.

Se detectaron altos porcentajes de resistencia para ampicilina (77,1%), ciprofloxacina (74,3%), trimetoprim/sulfametoxazol (62,9%), cefepime (57,1%), cefuroxima (57,1%) y ampicilina con sulbactam (40%). Los aislados de pacientes de sexo masculino presentaron los niveles de resistencia más altos (Figura 1). Sin embargo, solo los aislados provenientes de pacientes femeninos presentaron resistencia a ceftazidima (10,7%, n=6), aztreonam (3,6%, n=2), cefotaxima (3,6%, n=2), tigeciclina (1,8%, n=1). Estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p>0,05). No se detectaron aislados resistentes a amikacina, ertapenem, imipenem y meropenem.

La familia de genes bla _TEM fue detectada por PCR en un 31,4% (22/70), seguido por bla _CTX-M (18,6%, n=13) y bla _SHV (2,9%, n=2), tanto en aislados productores y no productores de BLEE. Del total de aislados BLEE, el 56,4% (22/39) fue positivo para al menos uno de los genes evaluados. El gen bla _CTX-M fue el más común (28,2%, 11/39), de los cuales solo un aislado lo presentó en combinación con el gen bla _SHV. El 25,6% (10/39) de los aislados productores de BLEE presentaron el gen bla _TEM. No se evidenció la presencia conjunta de los genes bla _CTX-M y bla _TEM. Del total de aislados no productores de BLEE, el 54,8% (17/31) no presentó ninguno de los genes evaluados. El 38% (12/31) presentó el gen bla _TEM y solo el 6,5% (n=2) el gen bla _CTX-M. Del total de aislados productores y no productores de BLEE, no se detectó la presencia del gen bla _PER (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Los aislados de E. coli de pacientes con ITU presentaron altos niveles de resistencia a antimicrobianos de importancia clínica. Más del 50% de los aislados fue clasificado como MDR y productor de BLEE. Las resistencias más frecuentes fueron para ampicilina, ciprofloxacina y trimetoprim/sulfametoxazol, antimicrobianos usados con frecuencia para el tratamiento de ITU ¹³13. Huang ES, Stafford RS. National patterns in the treatment of urinary tract infections in women by ambulatory care physicians. Arch Intern Med. 2002;162(1):41-7. doi: 10.1001/archinte.162.1.41.
https://doi.org/10.1001/archinte.162.1.4... . Además, se encontraron aislados resistentes a colistina, una droga de último recurso utilizada en ITU complicada causada por bacterias MDR ¹⁴14. Cui P, Niu H, Shi W, Zhang S, Zhang H, Margolick J, et al. Disruption of Membrane by Colistin Kills Uropathogenic Escherichia coli Persisters and Enhances Killing of Other Antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(11):6867-6871. doi: 10.1128/AAC.01481-16.
https://doi.org/10.1128/AAC.01481-16... . No se detectaron aislados resistentes a imipenem, meropenem y ertapenem. Sin embargo, la detección de aislados de E. coli uropatógenos productores de BLEE representa un riesgo potencial de desarrollo de resistencia, debido a su capacidad de transportar genes de resistencia a otros antimicrobianos ¹⁵15. Carattoli A. Plasmids in Gram negatives: molecular typing of resistance plasmids. Int J Med Microbiol. 2011;301(8):654-8. doi: 10.1016/j.ijmm.2011.09.003.
https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2011.09.0... .

Los aislados de pacientes de sexo masculino exhibieron mayores niveles de resistencia para ampicilina, ciprofloxacina, trimetoprim/sulfametoxazol, cefepime, cefuroxima, ampicilina con sulbactam, tobramicina, gentamicina, amoxicilina con ácido clavulánico, colistina y piperacilina con tazobactam. Las diferencias encontradas según el sexo de los pacientes no fueron significativas, por lo que no podemos evidenciar que ser un paciente de sexo masculino sería un indicador para la selección empírica de antimicrobianos para el tratamiento de ITUs. Sin embargo, nuestros resultados muestran una alta prevalencia de E. coli resistente a diversos antimicrobianos de uso frecuente en estas infecciones. Se debe considerar un mayor cuidado en la selección de esquemas terapéuticos por parte de los médicos tratantes para evitar así una presión selectiva que conlleve a la emergencia de cepas MDR.

La familia de genes bla _TEM fue la más frecuente, seguida por bla _CTX-M y bla _SHV. Estos resultados contrastan con los encontrados por otros autores, siendo el gen bla _CTX-M el más frecuente en pacientes con ITU en el Perú ¹⁶16. Galván F, Agapito J, Bravo N, Lagos J, Tamariz J. Caracterización fenotípica y molecular de Escherichia coli productoras de ß-Lactamasas de espectro extendido en pacientes ambulatorios de Lima, Perú. Rev Medica Hered. 2016;27:22. doi:10.20453/rmh.v27i1.2780.
https://doi.org/10.20453/rmh.v27i1.2780...

17. Salles MJ, Zurita J, Mejía C, Villegas MV; Latin America Working Group on Bacterial Resistance. Resistant gram-negative infections in the outpatient setting in Latin America. Epidemiol Infect. 2013;141(12):2459-72. doi: 10.1017/S095026881300191X.
https://doi.org/10.1017/S095026881300191... ^-1818. Miranda J, Pinto J, Faustino M, Sánchez-Jacinto B, Ramirez F. Antimicrobial resistance of uropathogens in older adults in a private clinic in Lima, Peru. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2019;36(1):87-92. doi: 10.17843/rpmesp.2019.361.3765.
https://doi.org/10.17843/rpmesp.2019.361... . Un total de 17 aislados productores de BLEE fueron negativos para todos los genes evaluados. Inclusive, se detectó la presencia de los genes blaCTX_-M (n=2) y bla _TEM (n=12) en los aislados identificados como no productores de BLEE. Las diferencias observadas en la detección de aislados BLEE por métodos fenotípicos y genotípicos reflejan la baja sensibilidad que posee el método fenotípico y la posible influencia de factores externos en la presentación de resistencia. Posiblemente, muchos aislados no produjeron BLEE a niveles detectables por el método fenotípico, lo que podría explicar la presencia de aislados BLEE negativos, pero con genes relacionados a la producción de esas enzimas. En contraste al método fenotípico, la detección de genes mediante la amplificación de PCR posee mejores niveles de especificidad y sensibilidad. Sin embargo, estos valores están estrechamente correlacionados a la calidad y diseño de cebadores. Inclusive, variantes de genes bla _TEM o bla _SHV no BLEE han sido descritas, por lo que métodos de secuenciamiento resultan esenciales para su identificación y caracterización ¹⁹19. Pitout JD, Laupland KB. Extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging public-health concern. Lancet Infect Dis. 2008;8(3):159-66. doi: 10.1016/S1473-3099(08)70041-0.
https://doi.org/10.1016/S1473-3099(08)70... .

En conclusión, los resultados evidencian altos niveles de resistencia en aislados de E. coli portadores de los genes bla _TEM, bla _CTX-M y bla _SHV recuperados de pacientes ambulatorios con diagnóstico de ITU en distintas regiones del Perú. Los hospitales peruanos públicos realizan el monitoreo de la resistencia antimicrobiana utilizando principalmente métodos fenotípicos y en menor medida, métodos moleculares. Sin embargo, estas metodologías pueden no reflejar de manera correcta el estado de la resistencia antimicrobiana en este y otros tipos de infecciones. Por ello, resulta necesaria la implementación de métodos de última generación para la vigilancia genómica de la resistencia antimicrobiana en hospitales.

Los resultados presentados corresponden a una primera fase del estudio. Utilizaremos métodos de secuenciamiento del genoma completo y análisis bioinformático para el estudio de la resistencia antimicrobiana en estos aislados bacterianos. La información generada servirá como herramienta epidemiológica para determinar la distribución de los genes de resistencia y también como una guía para evaluar la tendencia y posibles cambios en los esquemas terapéuticos por parte de los médicos tratantes.

Agradecimientos:

A los docentes de la Escuela de Medicina Humana de la Universidad Peruana Unión (Salomón Huancahuire y Miguel Otiniano), al personal del Laboratorio de Genómica Microbiana de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (Brenda Ayzanoa, Janet Huancachoque y Camila Castillo) y a Marco Galarza del Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud por su apoyo en la recolección de aislados.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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