RESUMEN

Objetivo

. Analizar y determinar la actividad antifúngica in vitro del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers.

Materiales y métodos

. Se realizó el análisis fitoquímico preliminar cualitativo mediante reacciones de color y precipitación. Se investigó la actividad antifúngica in vitro frente a Candida albicans, Aspergillus brasilensis y Trichophyton mentagrophytes usando el método de difusión en pozo de agar y el ensayo de la concentración mínima inhibitoria (CMI).

Resultados

. El análisis fitoquímico preliminar cualitativo mostró la presencia de compuestos fenólicos, taninos, flavonoides, esteroides, alcaloides y saponinas. La actividad antifúngica in vitro fue demostrada para todos cultivos fúngicos con halos de inhibición entre 23 a 26 mm. Los valores de la CMI fueron de 125, 250 y 125 µg/mL para C. albicans, A. brasilensis y T. mentagrophytes, respectivamente.

Conclusiones.

El extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers contiene importantes metabolitos secundarios y tiene moderada actividad antifúngica.

Palabras clave:
Antifúngicos; extractos vegetales; fitoquímicos; in vitro

MENSAJES CLAVE

1. Motivación para realizar el estudio: este estudio busca validar el uso etnobotánico de Solanum hispidum Pers como antifúngico, así como contribuir a evaluar su fitoquímica para poder determinar los principales metabolitos y demostrar la actividad in vitro frente a diferentes agentes fúngicos.
2. Principales hallazgos: se evidenció la presencia principal de esteroides y alcaloides en el extracto, así como la actividad antifúngica moderada frente a C. albicans ATCC 10231, A. brasilensis ATCC 16404 y T. mentagrophytes ATCC 9533.
3. Implicancias: es necesario que se continúe investigando este tema, con el propósito de obtener la formulación de fitofármacos de aplicación tópica con actividad antifúngica, y que, además, sean asequibles.

Palabras clave:
Antifúngicos; extractos vegetales; fitoquímicos; in vitro

INTRODUCCIÓN

Los extractos vegetales son ampliamente usados en el tratamiento de enfermedades, particularmente como antifúngicos. Actualmente, las investigaciones enfocadas en sus componentes biológicos activos son prometedoras; asimismo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha propuesto que se considere la inclusión de la medicina tradicional en el sistema de atención de la salud ¹1. Organización Mundial de la Salud. Estrategia de la OMS sobre medicina tradicional 2014-2023 [Internet]. Ginebra, Suiza; 2013 [citado el 10 de febrero de 2022]. Disponible https://apps.who.int/iris/handle/10665/95008.
https://apps.who.int/iris/handle/10665/9... .

Las dermatomicosis constituyen una de las enfermedades cutáneas más frecuentes, los estudios epidemiológicos en nuestro país sobre la incidencia en la población son numerosos ²2. Bejar V, Villanueva F, Guevara JM, González S, Vergaray G, Abanto E, et al. Epidemiología de las dermatomicosis en 30 años de estudio en el Instituto de Medicina Tropical Daniel A. Carrión. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. An Fac med. [Internet]. 2014 [citado el 01 de julio de 2019]; 75(2):167-72. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1025-55832014000200013&lng=es.
http://www.scielo.org.pe/scielo.org.pe/s... . La resistencia a los fármacos, los fracasos terapéuticos, los efectos adversos y la toxicidad que existe con el uso de antimicóticos convencionales representan un problema, por lo que es necesario buscar nuevas alternativas para el tratamiento ³3. Sandoval N, Arenas R, Giusiano G, Garcia D, Chávez L, Zuñiga P. Diagnóstico y tratamiento de dermatofitosis y pitiriasis versicolor. Rev Med Hondur. [Internet]. 2012 [citado el 05 de agosto del 2021]; 80(2): 66-74. Disponible en www.bvs.hn/RMH/pdf/2012/pdf/Vol80-2-2012-8.pdf.
www.bvs.hn/RMH/pdf/2012/pdf/Vol80-2-2012... . La medicina tradicional representa una opción importante, sin embargo, necesita ser validada científicamente hacia la medicina convencional.

La familia Solanaceae es una de las más diversas y el género Solanum está ampliamente distribuido en el Perú; Solanum hispidum Pers se encuentra entre 2500 a 3500 m de altitud ⁴4. Särkinen T, Baden M, Gonzáles P, Cueva M, Giacomin L, Spooner D, et al. Listado anotado de Solanum L. (Solanaceae) en el Perú. Rev Peru Biol. 2015; 22 (1): 003-62. doi: 10.15381/rpb.v22i1.11121.
https://doi.org/10.15381/rpb.v22i1.11121... . Esta planta crece abundantemente en Carhuaz, donde se le conoce como ñahui pashta y es tradicionalmente usada por la población local para el tratamiento de micosis de los pies mediante aplicación tópica del contenido de los frutos ⁽⁵5. Mendoza León JC. Actividad antifúngica del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers y citotoxicidad en líneas celulares de cáncer humano. [Tesis de maestría] Lima: Facultad de Farmacia y Bioquímica UNMSM; 2022..

Estudios previos han demostrado la actividad antifúngica in vitro de varias especies del género Solanum, como Solanum crysotrichum para patógenos como Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Trichophyton gypseum⁶6. Zamilpa A, Tortoriello J, Navarro V, Delgado G, Alvarez L. Five new steroidal saponins from Solanum chrysotrichum leaves and their antimycotic activity. J Nat Prod. 2002; 65(12):1815-9. doi: 10.2021/np020261h.
https://doi.org/10.2021/np020261h... . Posteriormente, se realizaron estudios clínicos en una crema derivada del extracto metanólico de sus hojas, la cual mostró efectividad en Tinea pedís ⁽⁷7. Herrera-Arellano A, Rodríguez-Soberanes A, de los Angeles Martínez-Rivera M, Martínez-Cruz E, Zamilpa A, Alvarez L, et al. Effectiveness and tolerability of a standardized phytodrug derived from Solanum chrysotrichum on Tinea pedis: a controlled and randomized clinical trial. Planta Med. 2003 May; 69(5):390-5. doi: 10.1055/s-2003-39710.
https://doi.org/10.1055/s-2003-39710... . Solanum melongena demostró actividad antifúngica contra Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichopyton tonsurans, Candida albicans y Trichosporon beigeii⁸8. Das J, Lahan JP, Srivastava RB. Solanum melongena: A potential source of antifungal agent. Indian J Microbiol. 2010; 50(1):62-69. doi:10.1007/s12088-010-0004-2.
https://doi.org/10.1007/s12088-010-0004-... . Además, se evidenció que Solanum xanthocarpum inhibe el crecimiento de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y Aspergillus niger⁹9. Dabur R, Singh H, Chhillar AK, Ali M, Sharma GL. Antifungal potential of Indian medicinal plants. Fitoterapia. 2004 Jun; 75(3-4):389-91. doi: 10.1016/j.fitote.2004.01.015.
https://doi.org/10.1016/j.fitote.2004.01... , otros estudios recientes demostraron también la actividad antifúngica frente a Candida albicans¹⁰10. Garhewall S, Shiv G, Wast N. Anti-fungal activity fo Solanum xanthocarpum (kantkari) eaf extract. World Journal of Zoology. 2014; 9(2):111-4. doi: 10.5829/idosi.wjz.2014.9.2.83310.
https://doi.org/10.5829/idosi.wjz.2014.9... . La especie Solanum nigrum L posee actividad antifúngica contra Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum y Candida albicans¹¹11. Shivakumar SP, Vidyasagar GM. Antimycotic activity of low polar petroleum ether and interpolar methanolic young leaf extracts of Solanum nigrum L. Int Lett Nat Sci. 2015; 4 (1): 47-56. doi: 10.18052/www.scipress.com/ILNS.31.47.
https://doi.org/10.18052/www.scipress.co... ; y entre sus compuestos fitoquímicos se encontraron alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos y saponinas ¹²12. Chang HL, García-Lopez A, Rosabal CY, Espinosa RA, Ramos EM, Remon RH. Caracterización fitoquímica y la evaluación de la actividad antibacteriana in vitro de los extractos de hojas y tallos de Solanum nigrum L. que crece en Cuba. Rev Mex Cienc Farm [Internet]. 2013 [citado el 01 de mayo de 2022] ; 44( 4 ): 30-35. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-01952013000400004&lng=es.
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?scri... .

Las hojas de Solanum hispidum Pers son usadas como antimicótico en la medicina folclórica mexicana, y se demostró su actividad antifúngica contra Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Aspergillus niger y Candida albicans; las cepas que mostraron mayor sensibilidad fueron Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum; además, se determinaron y aislaron saponinas esteroidales ¹³13. González M, Zamilpa A, Marquina S, Navarro V, Alvarez L. Antimycotic spirostanol saponins from Solanum hispidum leaves and their structure-activity relationship. J Nat Prod. 2004 Jun; 67(6): 938-41. doi: 10.1021/np0305019.PMID: 15217270.
https://doi.org/10.1021/np0305019.PMID:... . Por otra parte, el estudio reciente de Retamozo ¹⁴14. Retamozo Montes A. Contenido de glicoalcaloides esteroidales totales en las hojas y frutos de Solanum hispidum Pers y Solanum radicans L y determinación de su bioactividad frente a Artemia salina. [Tesis de grado]. Ayacucho: Facultad de Ciencias de la Salud UNSCH; 2018. reportó la abundancia de glicoalcaloides esteroidales como principales metabolitos secundarios en hojas y frutos de esta especie. Sin embargo, no existe ningún estudio en Perú sobre la evaluación de sus propiedades frente a agentes fúngicos. Por lo tanto, el presente estudio tiene como objetivo el análisis fitoquímico preliminar y actividad antifúngica del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección del material vegetal

Se colectaron al azar hojas frescas de Solanum hispidum Pers de diferentes ejemplares distribuidos en el departamento de Ancash, provincia de Carhuaz, distrito de Acopampa, localidad de Obraje. Ubicada a una altitud de 2750 m de altitud (Figura 1).

La especie fue identificada taxonómicamente y certificada por el herbario San Marcos del Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (código: 053-USM-2017).

Obtención del extracto etanólico de la planta

Las hojas de Solanum hispidum Pers fueron lavadas con agua destilada e inicialmente secadas a temperatura ambiente durante siete días, luego se completó el secado a 40 °C en estufa con aire circulante por cinco días; posteriormente, las hojas se trituraron y molieron hasta obtener un polvo fino uniforme ¹⁵15. Seidel V. Una introducción al aislamiento de productos naturales. En: Sarker S, Nahar L. (eds) Aislamiento de productos naturales. Métodos en Biología Molecular [Internet]. Humana Press vol 864; 2012 [citado el 05 de marzo de 2021]. Disponible en: 10.1007/978-1-61779-624-1_2.
https://doi.org/10.1007/978-1-61779-624-... .

El polvo fue mezclado con etanol al 90% en una proporción 1:10 en un frasco de vidrio ámbar el cual se mantuvo a temperatura ambiente durante siete días con agitación manual frecuente. Luego, el extracto fue filtrado empleando una gasa y papel filtro de celulosa 20 µm; posteriormente, el solvente se evaporó bajo presión reducida en un rotaevaporador® (Buchi- R-100) a 40 °C y 60 rpm ¹⁵15. Seidel V. Una introducción al aislamiento de productos naturales. En: Sarker S, Nahar L. (eds) Aislamiento de productos naturales. Métodos en Biología Molecular [Internet]. Humana Press vol 864; 2012 [citado el 05 de marzo de 2021]. Disponible en: 10.1007/978-1-61779-624-1_2.
https://doi.org/10.1007/978-1-61779-624-... ^,1616. Singh J. Chapter 3 Maceration, Percolation and Infusion Techniques or the Extraction of Medicinal and Aromatic Plants. En: Handa S, Khanuja S, Longo G, Rakesh D. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants [Internet]. Trieste: ICS UNIDO; 2008 [citado el 30 de Julio de 2021]. Disponible en https:/www.unido.org/sites/default/files/2009-2010/Extraction.
https:/www.unido.org/sites/default/files... . El extracto seco se almacenó en refrigeración entre 2 a 8 ºC hasta su uso.

Prueba de solubilidad

Se colocó 20 mg del extracto etanólico estabilizado de Solanum hispidum Pers y se agregó 1 mL de cada uno de los siguientes solventes: agua destilada, etanol, metanol, acetato de etilo, cloroformo, éter dietílico y n-hexano. Luego se agitó cada tubo y se procedió a observar los resultados por un máximo de 10 min ¹⁷17. Dominguez X. Métodos de investigación fitoquímica. Limusa; 1973..

Análisis fitoquímico

Para determinar la presencia o ausencia de los principales metabolitos secundarios se realizaron las pruebas cualitativas de coloración y precipitación mediante los métodos químicos estándar descritos por Lock ¹⁸18. Lock O. INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA. Métodos en el estudio de productos naturales. 3ª ed. Lima: PUCP; 2016..

Microorganismos

Se emplearon cepas de Candida albicans ATCC 10231, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 y Aspergillus brasilensis ATCC 16404 provistos por el Cepario del Laboratorio de Microbiología y Biológicos del Instituto Nacional de Salud.

Las cepas de T. mentagrophytes y A. brasilensis fueron cultivados en agar dextrosa Sabouraud (ADS) durante 7 y 10 días, respectivamente. C. albicans se incubó en caldo dextrosa Sabouraud por 48 h, la temperatura de incubación fue 20 a 25 ºC. Las cepas se suspendieron y ajustaron con un espectofotómetro hasta lograr una concentración de 1 x 10⁶ UFC/mL para C. albicans y 1 x 10⁵ UFC/mL para T. mentagrophytes y A. brasiliensis, respectivamente ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... .

Actividad antifúngica in vitro

La actividad antifúngica del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers se realizó utilizando el método de difusión en pozos de agar ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... .

Se inoculó en 20 mL de agar dextrosa Sabouraud (ADS) 1 mL de la suspensión fúngica (0,5 x 10⁵ UFC/mL para C. albicans y 0,5 x 10⁴ UFC/mL para T. mentagrophytes y A. brasiliensis). Se mezcló uniformemente y se vertió homogéneamente en placas Petri, luego cuando la superficie se solidificó se perforó pozos de 11 mm de diámetro con un perforador de acero inoxidable estéril; se agregó 100 µL del extracto etanólico (25 mg/mL) a cada un pozo ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... . Posteriormente, las placas se incubaron a 37 °C por 24 h para C. albicans, 72 h para A. brasiliensis y siete días para T. mentagrophytes; como control negativo se empleó dimetilsulfóxido (DMSO) y agua destilada ²⁰20. Fernández TB, Cabañes F, Carrillo A, Esteban A, Inza I, Abarca L, Guarro J. Collaborative evaluation of optimal antifungal susceptibility testing conditions for dermatophytes. J Clin Microb.2002; 40(11): 3999-4003. doi: 10.1128/JCM.40.11.3999-4003.2022.
https://doi.org/10.1128/JCM.40.11.3999-4... ^,2121. Ruiz Quiroz JR. Actividad antifúngica in vitro y concentración mínima inhibitoria mediante microdilución de ocho plantas medicinales. [Tesis de maestría] Lima: Facultad de Farmacia y Bioquímica UNMSM; 2013..

Al finalizar el tiempo de incubación, se evaluó la actividad antifúngica midiendo el diámetro de la zona de inhibición en mm. La actividad antifúngica del extracto fue evaluada comparando las zonas de inhibición con antifúngicos estándar para cada microorganismo (nistatina a 0,2 mg/mL ketoconazol a 0,2 mg/mL y fluconazol a 0,2 mg/mL) ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... . Se realizaron ocho réplicas por cada cepa.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) se utilizó el método de microdilución colorimétrico en microplaca siguiendo los protocolos del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) ²²22. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard NCCLS document M27-A2. Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standard Institute. 2002.^,2323. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; approved standard CLSI document M38-A2. Wayne PA: Clinical Laboratory Standards Institute; 2008. modificado por Liu ²⁴24. Liu M, Seidel V, Katerere D, Gray A. Colorimetric broth microdilution method for the antifungal screening of plant extracts against yeast. Methods. 2007; 42: 325-329. doi: 10.1016/j.ymeth.2007.02.013.
https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.02.... y Fernández ²⁰20. Fernández TB, Cabañes F, Carrillo A, Esteban A, Inza I, Abarca L, Guarro J. Collaborative evaluation of optimal antifungal susceptibility testing conditions for dermatophytes. J Clin Microb.2002; 40(11): 3999-4003. doi: 10.1128/JCM.40.11.3999-4003.2022.
https://doi.org/10.1128/JCM.40.11.3999-4... .

Se obtuvieron suspensiones en RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) con resazurina para cada cepa: rangos de 0,5 - 2,5 x 10³ UFC/mL para C. albicans y rangos de 0,6 a 3 x 10⁴ UFC/mL para A. brasiliensis y T. mentagrophytes. Además, se prepararon diluciones seriadas del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers en medio RPMI 1640 (sigma-Aldrich) con resazurina, las concentraciones evaluadas estuvieron en rangos de 3,91 a 2000 µg/mL. Cada ensayo fue realizado por triplicado para cada cepa. Las placas se incubaron aeróbicamente a 37 ºC por 24 h para C. albicans, cinco días para A. brasiliensis y siete días para T. mentagrophytes. Culminado el tiempo de incubación se realizó la evaluación visual, cuando existe inhibición de la actividad biológica se reduce marcadamente el color original ²⁴24. Liu M, Seidel V, Katerere D, Gray A. Colorimetric broth microdilution method for the antifungal screening of plant extracts against yeast. Methods. 2007; 42: 325-329. doi: 10.1016/j.ymeth.2007.02.013.
https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.02.... .

En todos los ensayos se emplearon como controles positivos los antifúngicos ketoconazol y fluconazol en medio RPMI ²²22. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; approved standard NCCLS document M27-A2. Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standard Institute. 2002.^,2323. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; approved standard CLSI document M38-A2. Wayne PA: Clinical Laboratory Standards Institute; 2008. con resazurina 0,05 mg/mL y controles de esterilidad que contenían el medio de cultivo con resazurina 0,05 mg/mL sin el microorganismo ²¹21. Ruiz Quiroz JR. Actividad antifúngica in vitro y concentración mínima inhibitoria mediante microdilución de ocho plantas medicinales. [Tesis de maestría] Lima: Facultad de Farmacia y Bioquímica UNMSM; 2013..

Para la interpretación de la actividad antifúngica se empleó los criterios cualitativos descritos por Holets et al. (2002) ²⁵25. Holetz F, Pessini G, Sanches N, Garcia D, Nakamura C, Filho B. Screening of some plants used in the Brazilian folk medicine for the treatment of infectious diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2002; 97(7): 1027-1031. doi: 10.1590/S0074-02762002000700017.
https://doi.org/10.1590/S0074-0276200200... , es decir: CMI < 100 µg/Ml (buena), 100 a < 500 µg/mL (moderada), 500 a 1000 µg/mL (débil).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron analizados a través del software de MINITAB 19. Se realizó análisis estadístico descriptivo de las variables.

Aspectos éticos

Este proyecto fue aprobado por el Comité institucional de ética en investigación del Instituto Nacional de Salud (CIEI -INS), RD N.º 533-2019 OGITT/INS. Se utilizó cepas de la (ATCC) mantenidas en el Laboratorio de Microbiología y Biológicos del Instituto Nacional de Salud a -70 ºC. En este estudio no se involucraron pacientes.

RESULTADOS

Prueba de solubilidad

Las pruebas de solubilidad describen los resultados en la Tabla 1, en la cual se evidencia que el extracto etanólico estabilizado de las hojas de Solanum hispidum Pers resultó poco soluble (+) en el solvente n-hexano; soluble (++) en agua destilada, acetato de etilo, cloroformo, éter dietílico; muy solube (+++) en solventes alcohólicos como el etanol y metanol. La disminución de la solubilidad fue directamente proporcional al índice de polaridad del solvente de prueba.

Análisis fitoquímico preliminar

El extracto etanólico obtenido a partir de hojas de Solanum hispidum Pers presentó una variedad de metabolitos secundarios; se logró identificar compuestos fenólicos, taninos, flavonoides, esteroides, alcaloides y saponinas (Tabla 2).

Las cumarinas, naftoquinonas, antraquinonas, glucósidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas y leucoantocianinas no se encontraron en el extracto etanólico.

Actividad antifúngica in vitro

Se evaluó la actividad antifúngica in vitro mediante el método de difusión en cultivo de agar frente a microorganismos Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 y Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 y se demostró la actividad a través de los halos de inhibición. (Figura 2).

La Tabla 3, presenta los resultados de la actividad antifúngica de las hojas Solanum hispidum Pers. El ensayo demostró que para C. albicans el halo de inhibición fue de 26 mm (± 0,38), para A. brasiliensis se obtuvo un halo de 23 mm (± 0,53) y T. mentagrophytes reveló un halo de inhibición de 25 mm (± 1,31). De todos ellos, el extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers presentó mayor actividad para C. albicans, sin embargo, su control positivo (nistatina) presentó un halo mayor (30 mm) en comparación al extracto etanólico.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI)

Posterior a la demostración de actividad antifúngica, se realizó la CMI. Los resultados muestran que la concentración más baja del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers que inhibe completamente el crecimiento para C. albicans fue de 125 µg/mL; para A. brasiliensis fue de 250 µg/mL y para T. mentagrophytes fue de 125 µg/mL; en base al criterio de actividad antifúngica, todas ellas demostraron actividad moderada (Tabla 4).

DISCUSIÓN

El presente estudio determinó que el extracto etanólico estabilizado de las hojas de Solanum hispidum Pers presenta una mayor solubilidad frente a etanol y metanol, es decir, con tendencia a solventes polares, ambos son usados ampliamente; sin embargo, en este estudio se continuó con etanol debido a la disponibilidad, considerando, además, que la mayoría de metabolitos con actividad antifúngica poseen polaridad intermedia y pueden concentrarse fácilmente en este tipo de solventes ²⁶26. Abbas K, Hussain T, Speed M, Javaid Z, Idrees A, Rasool S. Antimicrobial activity of fruits of Solanum nigrum and Solanum xanthocarpum. Acta Pol Pharm [Internet].2014 [citado el 03 de marzo de 2022]; 71(3):415-21. Disponible en https://www.ptfarm.pl/File/Acta_poloniae/2014/3/415.pdf.
https://www.ptfarm.pl/File/Acta_poloniae... . Nuestros resultados son concordantes con otros estudios realizados en extractos crudos ²⁴24. Liu M, Seidel V, Katerere D, Gray A. Colorimetric broth microdilution method for the antifungal screening of plant extracts against yeast. Methods. 2007; 42: 325-329. doi: 10.1016/j.ymeth.2007.02.013.
https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.02.... .

Los análisis cualitativos fueron desarrollados para detectar los metabolitos presentes en el extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers, los resultaron evidenciaron la presencia de múltiples metabolitos como compuestos fenólicos, taninos, flavonoides, esteroides, alcaloides y saponinas; además, para asegurar su presencia inequívoca se usaron cuatro pruebas diferentes para alcaloides y cuatro pruebas diferenciales para esteroides con respecto a los triterpenoides ¹⁸18. Lock O. INVESTIGACIÓN FITOQUÍMICA. Métodos en el estudio de productos naturales. 3ª ed. Lima: PUCP; 2016., demostrando así la confiabilidad de los resultados.

En este sentido, se ha reportado que el género Solanum presenta abundancia de alcaloides y esteroides tal es el caso se Solanum chrysotrichum⁶6. Zamilpa A, Tortoriello J, Navarro V, Delgado G, Alvarez L. Five new steroidal saponins from Solanum chrysotrichum leaves and their antimycotic activity. J Nat Prod. 2002; 65(12):1815-9. doi: 10.2021/np020261h.
https://doi.org/10.2021/np020261h... ^,77. Herrera-Arellano A, Rodríguez-Soberanes A, de los Angeles Martínez-Rivera M, Martínez-Cruz E, Zamilpa A, Alvarez L, et al. Effectiveness and tolerability of a standardized phytodrug derived from Solanum chrysotrichum on Tinea pedis: a controlled and randomized clinical trial. Planta Med. 2003 May; 69(5):390-5. doi: 10.1055/s-2003-39710.
https://doi.org/10.1055/s-2003-39710... , Solanum xanthocarpum²⁷27. Shubha KS, Sumana K, Lakshmidevi L. Antifungal Activity of Solanum xantocarpum Sch and Wend and Picrorhiza kurroa Royle ex Benth against Some Clinical Dermatophytes. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 2016; 5(2): 236-44. doi: 10.2546/ijcmas.2016.502.026
https://doi.org/10.2546/ijcmas.2016.502.... , Solanum nigrum¹¹11. Shivakumar SP, Vidyasagar GM. Antimycotic activity of low polar petroleum ether and interpolar methanolic young leaf extracts of Solanum nigrum L. Int Lett Nat Sci. 2015; 4 (1): 47-56. doi: 10.18052/www.scipress.com/ILNS.31.47.
https://doi.org/10.18052/www.scipress.co... , Solanum surattense²⁸28. Shivakumar T, Pasupuleti S, Kumar K, Rani S, Basaiahgari P, Pabbaraju N. Phytochemical and pharmacological activities of Solanum surattense Burm f - A review. J Appl Pharm Sci. 2017; 9(3):126-36. doi: 10.7324/JAPS.2019.90318.
https://doi.org/10.7324/JAPS.2019.90318... y Solanum quitoense²⁹29. Flechas H, Sanchez L, Silva J. Phytochemical screening and performance calculation of steroidal saponins from three provenances of Solanum quitoense Var. Septentrionale "naranjillo". Colombia for. [Internet]. 2008 [Citado el 30 de agosto de 2021]; 11(1): 201-11. Disponible en http://scielo.org.co/php?Script=sci_arttext&pid=S0120-073920080001000013&ing=en.
http://scielo.org.co/php?Script=sci_artt... . Retamozo ¹⁴14. Retamozo Montes A. Contenido de glicoalcaloides esteroidales totales en las hojas y frutos de Solanum hispidum Pers y Solanum radicans L y determinación de su bioactividad frente a Artemia salina. [Tesis de grado]. Ayacucho: Facultad de Ciencias de la Salud UNSCH; 2018.⁾ logró identificar glicoalcaloides esteroidales a través de pruebas cualicuantitativas en la misma especie Solanum hispidum Pers; además, analizó el contenido en hojas y frutos, demostrando un mayor contenido en el fruto a comparación de las hojas; también se explica que la variabilidad del contenido está influenciada por diferentes factores como estado vegetativo, época de colecta, procedencia, etc. Por lo tanto, se confirma la presencia de alcaloides y esteroides como componentes del extracto de las hojas de Solanum hispidum Pers.

Se empleó la concentración del extracto a 25 mg/mL en DMSO, en base a estudios previos de tamizaje de extractos etanólicos de plantas peruanas con actividad antifúngica; Rojas et al. ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... y Quiroz ²¹21. Ruiz Quiroz JR. Actividad antifúngica in vitro y concentración mínima inhibitoria mediante microdilución de ocho plantas medicinales. [Tesis de maestría] Lima: Facultad de Farmacia y Bioquímica UNMSM; 2013.⁾ obtuvieron resultados favorables utilizando esa concentración en 24 y 8 plantas medicinales, respectivamente^,

Respecto a la actividad antifúngica, el extracto etanolico de las hojas Solanum hispidum Pers mostró un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de C. albicans, A. brasiliensis y T. mentagrophytes con zonas de inhibición entre 23 a 26 mm. En este sentido, Rojas et al. ⁽¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... mencionaron que la actividad antifúngica con halos de inhibición superiores a 18 mm, utilizando el método de difusión en pozo de agar, es un indicador del buen desempeño como potencial agente terapéutico.

La investigación realizada por Das et al.⁸8. Das J, Lahan JP, Srivastava RB. Solanum melongena: A potential source of antifungal agent. Indian J Microbiol. 2010; 50(1):62-69. doi:10.1007/s12088-010-0004-2.
https://doi.org/10.1007/s12088-010-0004-... demostró halos de 18 mm contra el patógeno C. albicans empleando Solanum melongena; por su parte Shubha et al. ²⁷27. Shubha KS, Sumana K, Lakshmidevi L. Antifungal Activity of Solanum xantocarpum Sch and Wend and Picrorhiza kurroa Royle ex Benth against Some Clinical Dermatophytes. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 2016; 5(2): 236-44. doi: 10.2546/ijcmas.2016.502.026
https://doi.org/10.2546/ijcmas.2016.502.... ^), reportaron halos de 12 mm empleando extracto de Solanum xantocarpum; ambas especies pertenecen de la familia Solanaceae. En estudios previos, las especies Solanum nigrum y Solanum Xanthocarpum también demostraron actividad frente a C. albicans mediante el método de difusión en disco ²⁶26. Abbas K, Hussain T, Speed M, Javaid Z, Idrees A, Rasool S. Antimicrobial activity of fruits of Solanum nigrum and Solanum xanthocarpum. Acta Pol Pharm [Internet].2014 [citado el 03 de marzo de 2022]; 71(3):415-21. Disponible en https://www.ptfarm.pl/File/Acta_poloniae/2014/3/415.pdf.
https://www.ptfarm.pl/File/Acta_poloniae... . Además, un estudio de tamizaje de plantas peruanas reveló que una especie de la familia Solanaceae demostró mayor actividad, evidenciando zonas de inhibición de 19 mm con el método de difusión en pozo de agar ¹⁹19. Rojas R, Bustamante B, Bauer J, Fernandez I, Alban J, Lock O. Antimicrobial activity of select Peruvian Medicinal Plants. J Ethnopharmacol. 2003; 88(2-3): 199-204. doi: 10.1016/s0378-8741(03)00212-5.
https://doi.org/10.1016/s0378-8741(03)00... . Los resultados de esta investigación evidencian halos superiores de inhibición (≥ 23 mm) en comparación a los estudios frente a otras especies del género Solanum ^{(8, 19, 26, 27)}.

Así también, el presente estudio demostró una actividad antifúngica moderada para C. albicans con valores de 125 µg/mL, estos valores son menores a lo reportado en la especie de Solanum mammosum con valores de 256 µg/mL ³⁰30. Cabanillas B, Chassagne F, Vásquez P, Tahrioui A, Chevalier S, Vansteelandt M, et al. Pharmacological validation of Solanum mammosum L. as an anti-infective agent: Role of solamargine. J Ethnopharmacol. 2021;280(114473):1-8. doi: 10.1016/j.jep.2021.114473.
https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.11447... . También se ha reportado actividad antifúngica frente a otras especies fúngicas como Aspergillus sp; como Solanum xantocarpum contra A. niger¹⁰10. Garhewall S, Shiv G, Wast N. Anti-fungal activity fo Solanum xanthocarpum (kantkari) eaf extract. World Journal of Zoology. 2014; 9(2):111-4. doi: 10.5829/idosi.wjz.2014.9.2.83310.
https://doi.org/10.5829/idosi.wjz.2014.9... , mostrando actividad antifúngica con CMI de 250 µg/mL, estos valores también han sido hallados en nuestro estudio (250 µg/mL) frente a A. brasiliensis. Para el caso de Trichophyton mentagrophytes se evidenció la CMI de 125 µg/mL, resultados similares se reportaron con Solanum mammosum con valores de 256 µg/mL ³⁰30. Cabanillas B, Chassagne F, Vásquez P, Tahrioui A, Chevalier S, Vansteelandt M, et al. Pharmacological validation of Solanum mammosum L. as an anti-infective agent: Role of solamargine. J Ethnopharmacol. 2021;280(114473):1-8. doi: 10.1016/j.jep.2021.114473.
https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.11447... para T. mentagrofphytes.

Muchas especies de la familia Solanaceae como Solanum chrysotrichum⁶6. Zamilpa A, Tortoriello J, Navarro V, Delgado G, Alvarez L. Five new steroidal saponins from Solanum chrysotrichum leaves and their antimycotic activity. J Nat Prod. 2002; 65(12):1815-9. doi: 10.2021/np020261h.
https://doi.org/10.2021/np020261h... ^,77. Herrera-Arellano A, Rodríguez-Soberanes A, de los Angeles Martínez-Rivera M, Martínez-Cruz E, Zamilpa A, Alvarez L, et al. Effectiveness and tolerability of a standardized phytodrug derived from Solanum chrysotrichum on Tinea pedis: a controlled and randomized clinical trial. Planta Med. 2003 May; 69(5):390-5. doi: 10.1055/s-2003-39710.
https://doi.org/10.1055/s-2003-39710... , Solanum melogena⁸8. Das J, Lahan JP, Srivastava RB. Solanum melongena: A potential source of antifungal agent. Indian J Microbiol. 2010; 50(1):62-69. doi:10.1007/s12088-010-0004-2.
https://doi.org/10.1007/s12088-010-0004-... , Solanum nigrum¹¹11. Shivakumar SP, Vidyasagar GM. Antimycotic activity of low polar petroleum ether and interpolar methanolic young leaf extracts of Solanum nigrum L. Int Lett Nat Sci. 2015; 4 (1): 47-56. doi: 10.18052/www.scipress.com/ILNS.31.47.
https://doi.org/10.18052/www.scipress.co... , Solanum xanthocarpum²³23. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi; approved standard CLSI document M38-A2. Wayne PA: Clinical Laboratory Standards Institute; 2008. y Solanum mammosum³⁰30. Cabanillas B, Chassagne F, Vásquez P, Tahrioui A, Chevalier S, Vansteelandt M, et al. Pharmacological validation of Solanum mammosum L. as an anti-infective agent: Role of solamargine. J Ethnopharmacol. 2021;280(114473):1-8. doi: 10.1016/j.jep.2021.114473.
https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.11447... también demostraron actividad antifúngica, es posible que esta se deba a la presencia de saponinas, alcaloides, esteroides y/o flavonoides, los cuales pueden actuar de manera individual o sinérgica por un mecanismo de acción aún desconocido.

Tanto los esteroides como los alcaloides presentan alta actividad biológica y son un grupo de compuestos cíclicos que han sido estudiados debido a sus efectos antimicrobianos, esto ha sido reafirmado a través del aislamiento de compuestos bioactivos con potente actividad antifúngica in vitro³⁰30. Cabanillas B, Chassagne F, Vásquez P, Tahrioui A, Chevalier S, Vansteelandt M, et al. Pharmacological validation of Solanum mammosum L. as an anti-infective agent: Role of solamargine. J Ethnopharmacol. 2021;280(114473):1-8. doi: 10.1016/j.jep.2021.114473.
https://doi.org/10.1016/j.jep.2021.11447... .

Una de las limitaciones de nuestro estudio es que se utilizó exclusivamente las hojas y no los frutos, que también son usados en las zonas aledañas donde se recolectaron los especímenes. Esto se debe a que no son renovables y se prefirió no afectar su crecimiento natural y habitual; no obstante, se plantea en una siguiente etapa complementar con el fraccionamiento y la caracterización de los compuestos bioactivos de estos frutos, complementando así el estudio.

El presente estudio in vitro presenta un análisis fitoquímico preliminar del extracto de Solanum hispidum Pers., durante el cual se logró identificar los metabolitos secundarios principales, información no conocida previamente, además se demostró la actividad moderada antifúngica in vitro del extracto etanólico de las hojas de Solanum hispidum Pers.

Agradecimientos:

los autores agradecen al personal de apoyo del Centro Nacional de Control de Calidad del Instituto Nacional de Salud, especialmente al coordinador de investigación Roberto Torres Olivera por facilitarnos el uso de los laboratorios para el desarrollo de la presente investigación. A Jany Arias Tuco por el diseño y edición del mapa referencial de colecta.

Referencias bibliográficas

Fechas de Publicación

Histórico