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Toxoplasma gondii requiere la síntesis de novo de pirimidinas para ser virulento

 

 

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que puede producir malformaciones congénitas graves y encefalitis potencialmente mortal en pacientes inmunodeprimidos. El protozoo posee una vía fragmentada para rescatar las bases pirimidínicas derivadas del propio parásito o de la célula huésped, mediada exclusivamente por la uracilo-fosforibosiltransferasa. La interferencia en la función de esta enzima no afecta al crecimiento de los taquizoitos de T. gondii, lo cual indica que puede ser necesaria una vía de síntesis de novo de pirimidinas para que el parásito crezca.

Los autores de este informe analizaron la virulencia de mutantes de T. gondii carentes de carbamoil-fosfato-sintetasa II (auxotróficas para el uracilo) para determinar si dicha virulencia requiere la síntesis de novo de pirimidinas in vivo. Esta enzima CPSII es la enzima reguladora clave de la síntesis de novo de pirimidinas y presenta propiedades distintas de las de la CPSII de las células huésped de los mamíferos.

Se clonó un fragmento de ADN genómico CPSII HindIII de 6,6 kilobases (kb) de la cepa RH, que contiene exones que poseen una gran similitud con la CPSII de los hongos, plantas y mamíferos, y se alteró la única copia cromosómica de este fragmento para obtener las cepas cps1-1 y cps1-2, auxotróficas para el uracilo. Ninguna de estas dos cepas tenía actividad CPSII detectable, en comparación con la actividad detectada en la cepa salvaje RH. En ausencia de suplementos de uracilo el parásito invadía normalmente los tejidos, pero una vez dentro de las células era incapaz de replicarse. Con concentraciones de uracilo < 20 µM prácticamente no había crecimiento.

Se comprobó que la alteración del gen CPSII era la lesión genética responsable del auxotrofismo para el uracilo de las cepas cps1-1 y cps2-1. La transfección de estas cepas con un fragmento CPSII HindIII de 6,6 kb de la cepa RH rescató un número significativo de parásitos que pudieron crecer normalmente en ausencia de uracilo.

La virulencia de los mutantes de T. gondii con el gen CPSII anulado se probó en un modelo de toxoplasmosis letal en ratones BALB/c. La cepa RH es hipervirulenta en todas las cepas de ratones, con una dosis letal del 100% de aproximadamente 10 parásitos. Los ratones inyectados por vía intraperitoneal con una pequeña dosis de esta cepa mueren rápidamente (supervivencia mediana de 9 días). En cambio, los ratones inyectados con 103 a 107 taquizoitos de las cepas mutantes cps1-1 o cps2-1 sobrevivieron a la infección y 3 semanas después de la inoculación no se recuperaron parásitos de la cavidad peritoneal. Los ratones inoculados con estas cepas sobrevivieron más de 12 meses sin que se observaran signos de persistencia del parásito. En cambio, los parásitos rescatados por transfección de las cepas auxotróficas para el uracilo con el fragmento CPSII HindIII de 6,6 kb salvaje fueron altamente virulentos.

También se investigó la virulencia de la cepa cps1-1 en ratones BALB/c con el gen del interferón g (IFN-g) anulado. Como el IFN-g es necesario para que el huésped pueda controlar la infección por T. gondii, los ratones con este gen anulado sucumben rápidamente a la toxoplasmosis, incluso tras la infección con cepas normalmente avirulentas. Así pues, como era de esperar, estos ratones fallecieron rápidamente tras la infección con la cepa RH (supervivencia mediana de 9 días), pero, inesperadamente sobrevivieron más de 6 meses a la infección con inóculos de 103 a 107 taquizoitos de la cepa mutante cps1-1, sin mostrar signos de persistencia del parásito.

Por último, se investigó si los mutantes avirulentos auxotróficos para el uracilo podían proteger a los ratones frente a la infección letal por toxoplasma. Para ello se inyectaron taquizoitos de la cepa cps1-1 en ratones BALB/c y 40 días después se les inyectó una dosis letal de la cepa RH. Las dosis > 104 taquizoitos de la cepa cps1-1 fueron altamente eficaces para inducir inmunidad protectora a largo plazo en los ratones BALB/c.

Los resultados de este estudio indican que T. gondii podría depender totalmente de su propia vía de síntesis de novo de pirimidinas in vivo. Por consiguiente, la identificación de compuestos que limiten la biosíntesis de novo de pirimidinas en T. gondii podría ser útil para desarrollar nuevos fármacos antiparasitarios. Los mutantes auxotróficos descritos en este estudio son notablemente avirulentos y, además, pueden inducir inmunidad protectora a largo plazo frente a la toxoplasmosis, por lo que también resultan muy prometedores para el desarrollo de una vacuna frente a ella. (Fox BA, Bzik DJ. De novo pyrimidine biosynthesis is required for virulence of Toxoplasma gondii [Letter]. Nature 2002;415(6874): 926-929.)

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