ARTIGO ORIGINAL
Pesquisa de antigenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3 em cepas de Bordetella pertussis, isoladas de crianças com coqueluche atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, Brasil
Determination of 1, 2 and 3 major antigens in Bordetella pertussis strains isolated from Brazilian children with whooping-cough
Sebastião Timo Iaria
Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP "Setor Saúde Pública" Av. Dr. Arnaldo, 715 São Paulo, SP Brasil
RESUMO
Em 30 cepas de Bordetella pertussis isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, foram pesquisados os antígenos aglutinantes ''major" 1, 2 e 3. Levando-se em conta a presença combinada dos três antígenos, as provas de soro-aglutinação rápida em lamina revelaram que 25 (83,3%) cepas possuiam os fatores 1, 2 e 3, enquanto que 3 (10,0%) e 2 (6,7%) foram positivas, somente, para 1, 2 e 1, 3, respectivamente. Os resultados foram discutidos, considerando-se a importância deste antígeno no preparo de vacinas.
Unitermos: Coqueluche, diagnóstico de laboratório. Bordetella pertussis. Coqueluche, vacina.
ABSTRACT
The presence of major antigens, 1, 2 and 3 were determined in 30 strains of B. pertussis isolated from children with whooping-cough hospitalized at the Hospital Emílio Ribas, São Paulo Brazil. The method used was the slide-agglutination test. Tests showed that 25(83.3%) of strains were positives for factors 1, 2 and 3. Factores 1 and 3 alone were present in 3 (10%) of strains and 1 and 2 alone in 2 (6.7%).
Uniterms: Whooping-cough diagnosis, laboratory. Bordetella pertussis. Pertussis vaccine.
INTRODUÇÃO
No passado considerava-se a Bordetella pertussis como um único tipo antigênico. Leslie & Gardner12 (1931), porém, verificaram que estas bactérias podem apresentar-se em 4 fases: I, II, III e IV. Quando recentemente isoladas, elas se apresentam na fase I e lisa e, através de sub-culturas ou em culturas velhas, vão sofrendo modificações até chegarem à fase IV, tornando-se rugosa e avirulenta. As fases II e III são intermediárias.
Estudando cepas de B. pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica, muitos anos mais tarde, Andersen 1 (1952) observou, através da prova de aglutinação, a presença de dois tipos de antígenos, sendo um do tipo "O", termoestável e comum às três espécies e um do tipo "K", de envoltório, compreendendo vários fatores termolábeis. Esse autor denominou os fatores "K" termolábeis de a, a1, a2, a3, a4, a5 e f para a B. pertussis, b, bl e g para B. parapertussis e c, cl, d, dl e g para a B. bronchiseptica. Um ano mais tarde, os antígenos "K" da B. pertussis foram denominados 1, 2, 3, 4 e 5, após terem sido estudadas cepas isoladas, empregando-se soros monoespecíficos absorvidos (Andersen2, 1953).
Eldering e col.9 (1957) num estudo sobre antígenos termolábeis, por meio da técnica de absorção de aglutininas e da prova de soro-aglutinação, identificaram nas bactérias do gênero Bordetella, 14 fatores antigênicos "K", numerados de 1 a 14. Segundo estes pesquisadores, na B. pertussis o antígeno 1 mostra-se presente em todas as cepas e as diferenças sorológicas são dadas pela presença ou ausência dos antígenos 2, 3, 4, 5 e 6, em combinações várias; na B. parapertussis o antígeno comum é o 14, porém pode conter também os de números 8, 9 e 10; com relação à B. bronchiseptica, o antígeno comum é o 12, podendo possuir também os de números 8, 9, 10 e 11. O antígeno 13 pode estar presente nas B. pertussis e B. bronchiseptica e o 7 é comum às três espécies. Este último é mencionado por Kendrick e col. 11 (1970) como "antígeno hipotético" Da forma "S" ou lisa de B. pertussis, vários componentes antigênicos têm sido isolados, como toxinas, aglutinogênios (Flosdorf & Kimball (1940), citados por Bradford3, 1965) e antígenos ditos protetores (Bradford 3, 1965).
Pelo exposto, parece que a estrutura antigênica da B. pertussis não está, até o momento, totalmente bem conhecida. O seu conhecimento, porém, é muito importante porque dele depende o preparo de vacinas eficientes para a adequada imunoprofilaxia da coqueluche.
A este respeito, é importante referir as investigações realizadas por Preston & Punga22, Preston 19,20 (1963 e 1965) Preston & Evans21 (1963), os quais relacionaram a eficiência de vacinas com os antígenos "K" presentes nas mesmas e em estirpes de B. pertussis isoladas de doentes.
No Brasil, poucas pesquisas foram feitas sobre a eficiência de vacinas contra a coqueluche, entre elas a de Lima & Arantes 13 (1943) relativamente ao preparo e doses a serem aplicadas e, a de Sampaio 26 (1954) o qual estudou, empregando vacina importada, a capacidade de produção de anticorpos em crianças, medida através de provas c!e soro-aglutinação. Entretanto, objetivando o conhecimento da presença dos antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3 em cepas de B. pertussis isoladas de doente com coqueluche, apenas uma investigação foi realizada em nosso meio, no Rio de Janeiro (Ubatuba & Salmito 30, 1970).
O presente estudo tem por finalidade verificar a presença desses antígenos em cepas de B. pertussis, isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo.
MATERIAL E MÉTODOS
Logo após terem sido identificadas morfológica, bioquímica e urologicamente, 30 cepas de B. pertussis, isoladas em 1969 e 1970 de crianças com coqueluche atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo (Iaria10, 1973), foram submetidas a provas de soro-aglutinação rápida, a fim de ser determinada a presença dos antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3.
Nestas provas foram empregados soros mono-específicos contra os antígenos aglutinantes 1, 2 e 3 *
As referidas provas de soroaglutinação foram realizadas empregando-se a técnica de Preston 19 (1963). Assim, inicialmente, prepararam-se suspensões espessas das cepas de B. pertussis, em solução de cloreto de sódio a 0,85%, partindo-se de culturas com 48 horas a 35°C, em meio de Bordet & Gengou contendo 50% de sangue desfibrinado de carneiro. A seguir foram misturadas, em lâminas separadas, uma gota de suspensão bacteriana e uma gota de soros monoespecíficos anti-antígenos 1, 2 e 3. A homogeneização das misturas foi feita, inicialmente, com alga de niquel-cromo e, posteriormente, por movimentação manual das lâminas.
As leituras, para a verificação da presença ou não de aglutinação, foram realizadas, sempre, até cinco min. após o início da prova, com o auxílio de uma lupa.
Paralelamente realizaram-se provas controles, misturando-se, em lâminas, uma gota da suspensão bacteriana em prova, com uma gota de solução de cloreto de sódio a 0,85%, a fim de se verificar a ocorrência ou não de auto-aglutinação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 30 cepas de B. pertussis submetidas a provas de soro-aglutinação, frente a soros monoespecíficos anti-fatores "major" 1, 2 e 3, todas revelaram-se possuidoras do antígeno 1, como era esperado. Por outro lado, 28 (93,0%) apresentaram o antígeno 2, e 27 (90,0%) mostraram-se positivas para o 3.
Entretanto, levando em conta a presença combinada dos três antígenos, por cepa, as provas de soro-aglutinação revelaram que das 30 cepas, 25 (83,3%) possuiam os fatores 1, 2 e 3, enquanto 3 (10,0%) mostraram-se positivas apenas para 1 e 3 e somente 2 (6,7%) para 1 e 2.
Apesar do número de observações ser relativamente pequeno, podemos verificar que pelos resultados houve grande predominância de cepas apresentando, simultaneamente, os fatores 1, 2 e 3.
Este mesmo fato, entre nós, foi também observado por Ubatuba & Salmito 30 (1970) no Rio de Janeiro, onde de 116 cepas isoladas de crianças com coqueluche, 70,0%) revelaram-se positivas para os fatores 1, 2 e 3, 18,0% somente para 1 e 3 e 12,0% apenas para 1 e 2. Assim, esses autores obtiveram, no Rio de Janeiro, um percentual menor de cepas apresentando os três fatores e, maior, respectivamente daquelas possuidoras dos fatores 1, 3 e 1, 2.
Considerando apenas os fatores "major" 1, 2 e 3 e comparando os resultados obtidos neste estudo com os valores encontrados em pesquisas realizadas em alguns países, podemos depreender que na Alemanha (Mebel 15, 1968) e na Rússia (Demina & Permitina, 1967, citados por Ubatuba & Salmito30, 1970) os isolamentos de cepas, apresentando aqueles três fatores, são também referidos como predominantes. Porém, em outros países como o Canadá (Chalvardjian4 1965), Inglaterra (Preston20, 1965), Holanda (Cohen 5, 1958) e Estados Unidos (Eldering e col.8, 1969) são mais freqüentes os isolamentos de cepas possuindo somente os fatores antigênicos 1 e 3.
O conhecimento da composição antigênica da B. pertussis é importante, levando-se em conta a sua identificação sorológica aplicada ao diagnóstico e à epidemiologia da coqueluche e, também, ao preparo de vacinas altamente eficientes para a adequada imunoprofilaxia desta doença.
Da forma "S" de B. pertussis, foram isolados vários componentes antigênicos, como toxinas termolábil e termoestável, aglutinógeno, não tóxico, com capacidade de determinar, em coelhos, níveis altos de aglutininas (Flosdorf & Kimbal, 1940, citados por Bradford 3, 1965; Smolens & Mudd28, 1943), hemaglutininas capazes de aglutinar hemácias humanas de camundongo e outros animais (Keogh & North, 1948, citados por Smith e col.27, 1964). Estes últimos antígenos têm a propriedade de provocar a formação de anticorpos específicos em animais (Marsy 14, 1952) e eventualmente no homem (Winter31, 1953), mas que não dão proteção contra a doença (Pillemeri18, 1950; Thiele29, 1950 e Winter 31, 1953). Têm sido descritos também os chamados antígenos protetores, porém são ainda mal conhecidos (Bradford 3, 1965). Já foi atribuída capacidade protetora a um carbohidrato (Cruickshank & Freeman 6, 1937 e Eldering 7, 1942) enquanto que Flosdorf & Kimbal, 1940, (citados por Bradford 3, 1965) e Smolens & Mudd 28 (1943) associaram o efeito protetor ao aglutinógeno. Por outro lado, Robbins & Pillemer 25 (1950) isolaram e purificaram um antígeno considerado protetor, a partir de um extrato aquoso de B. pertussis, o qual não era carbohidrato, aglutinógeno, toxina e nem hemaglutinina.
Vários são os estudos sobre a eficácia das vacinas contra a coqueluche e destes serão referidos alguns realizados na Inglaterra.
Foi efetuado pelo Medical Research Council 16 (1951) uma investigação em crianças com 6 a 18 meses de idade, divididos em dois grupos, sendo um vacinado contra a coqueluche e outro controle. Observadas por um período de dois a três anos, verificou-se que no grupo vacinado a incidência da coqueluche foi de 18,2% enquanto que no grupo controle foi de 87,3%. Alguns anos mais tarde, o próprio Medical Research Council 17 (1965), num estudo, comprovou a correlação entre a eficiência das vacinas e a prova de proteção, realizada pela técnica de inoculação da B. pertussis por via intracerebral em camundongos, previamente vacinados.
Por outro lado, Preston 19,20 (1953 e 1965) verificou que as amostras de vacinas por ele estudadas, preparadas na Inglaterra, apresentavam, dos antígenos termolábeis "major", na sua grande maioria, apenas os 1 e 2. Estas vacinas, segundo este pesquisador, eram altamente eficientes, pois a B. pertussis tipo 1, 2 que predominava naquele país antes de 1958, praticamente desapareceu. Verificou, também, que em 1963 e 1964 isolava-se o tipo 1, 2, 3 apenas de doentes não vacinados, e considerou que apesar de haver nas vacinas apenas os antígenos 1 e 2, elas davam também alguma proteção contra o tipo 1, 2, 3. Outrossim, de 155 cepas de B. pertussis, por ele isoladas de indivíduos vacinados e não vacinados, 85,0% pertenciam ao sorotipo 1, 3.
A este respeito, numa investigação feita pelo Public Health Laboratory Service 24 (1969) foi constado que, em 1966 a 1967, cerca de 50,0% das crianças vacinadas adquiriam coqueluche e de mais de 80,0% dos casos isolavam-se cepas do tipo 1, 3.
Mais recentemente, Preston & Stanbridge23 (1974) fizeram observações importantes relativamente a variações de sorotipos de B. pertussis. Verificaram que, por subculturas, cepas 1, 2, 3 mudaram para 1, 2 e cepas 1, 3 e 1, 2 para 1. Observaram também que cepas 1 se transformavam em 1, 2 ou 1, 3 e cepas 1, 2 em 1, 2, 3. Esses autores crêem que isto pode explicar as mudanças em sorotipos que são observadas no curso de uma infecção por B. pertussis. Isto também deve ser considerado com relação à possível instabilidade antigênica de cepas de laboratório, principalmente as utilizadas no preparo de vacinas e na produção e absorção de soros aglutinantes empregados no diagnóstico.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo permitem-nos apresentar as seguintes conclusões :
1. Das 30 cepas de B. pertussis isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, 80,0% possuiam os antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3; 10,0% e 6,7%, apresentaram, respectivamente, somente os antígenos 1 e 3 e 1 e 2.
2. Faz-se necessária em nosso meio, a atenção dos laboratórios relativamente à presença, nas vacinas contra a coqueluche, dos antígenos 1, 2 e 3, pelo fato da maioria das cepas isoladas dos casos clínicos da doença, possuirem esses antígenos.
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Recebido para publicação em 14/03/1977
Aprovado para publicação em 28/03/1977
* Soros preparados e gentilmente cedidos pela Dra. Arlete Ubatuba, do Instituto Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro Brasil