Resumo

INTRODUÇÃO

A Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu várias estratégias para o controle de populações de Aedes aegypti, particularmente a utilização de produtos químicos e biológicos integrados a programas de manejo ambiental capazes de eliminar formas larvais e insetos adultos.³¹31  World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. Geneva; 1970. (Technical Report Series, 443).

Os inseticidas químicos convencionais utilizados no controle de Aedes aegypti promovem a seleção de populações resistentes. É necessária a aplicação de dosagens crescentes, o que ocasiona efeitos tóxicos com acúmulo nos tecidos de animais e humanos e contaminação ambiental.⁴4  Braga IA, Valle D. Aedes aegypti: vigilância, monitoramento da resistência e alternativas de controle no Brasil. Epidemiol Serv Saude. 2007;16(4):295-302. DOI:10.5123/S1679-49742007000400007^,3030  Viegas Júnior C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle químico de insetos. Quim Nova. 2003;26(3):390-400. DOI:10.1590/S0100-40422003000300017
https://doi.org/10.1590/S0100-4042200300... A utilização contínua do controle biológico com toxina do Bacillus thuringiensis, variedade israelenses (BTI), também favorece seleção de populações de A. aegypti resistentes.²²22  Paris M, Tetreau G, Laurent F, Lelu M, Despres L, David JP. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag Sci. 2011;67(1):122-8. DOI:10.1002/ps.2046

Os compostos oriundos de plantas são as principais fontes de novas moléculas com potencial para interações com sistemas biológicos.¹³13  Macías FA, Oliveros-Bastidas A, Marín D, Carrera C, Chinchilla N, Molinillo JMG. Plant biocommunicators: their phytotoxicity, degradation studies and potential use as herbicide models. Phytochemistry Rev. 2008;7(1):179-94. DOI:10.1007/s11101-007-9062-4 Os inseticidas naturais vêm suprir as necessidades de alternativas ao controle de populações resistentes de Aedes aegypti, vetor de várias viroses. Agem em diferentes fases do desenvolvimento e apresentam diversos mecanismos de ação.¹⁸18  Navarro-Silva MA, Marques FA, Duque L JE. Review of semiochemicals that mediate the oviposition of mosquitoes: a possible sustainable tool for the control and monitoring of Culicidae. Rev Bras Entomol. 2009;53(1):1-6. DOI:10.1590/S0085-56262009000100002

A Azadirachta indica e a Carapa guianensis são da família Meliaceae. Possuem vários compostos com ação larvicida sobre Aedes aegypti, A. albopictus e Culex,²⁵25  Rossi JCN, Prophiro JS, Pedroso MF, Torquato MF, Emerick TV, Mendes S, et al. Uso do óleo de andiroba (Carapa guianensis - Meliaceae) como larvicida de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Rev Soc Bras Med Trop. 2005;41:78.^,2727  Silva OS, Romão PRT, Blazius RD, Prohiro JS. The use of andiroba Carapa guianensis as larvicide against Aedes albopictus. J Am Mosq Control Assoc. 2004;20(4):456-7. bem como ação inseticida, repelente, antifúngica, antimicrobiana, acaricida, antialimentar, regulador do crescimento, eficaz mesmo em baixa concentração e com baixa toxicidade para mamíferos.¹⁷17  Nakatani M, Abdelgaleil SAM, Saad MMG, Huang RC, Doe N, Iwagawa T. Phragmalin limonoids from Chukrasia tabularis. Phytochemistry. 2004;65(20):2833-41. DOI:10.1016/j.phytochem.2004.08.010^,1818  Navarro-Silva MA, Marques FA, Duque L JE. Review of semiochemicals that mediate the oviposition of mosquitoes: a possible sustainable tool for the control and monitoring of Culicidae. Rev Bras Entomol. 2009;53(1):1-6. DOI:10.1590/S0085-56262009000100002

A Melaleuca alternifolia pertence à família Myrtaceae e é utilizada por sua ação antimicrobiana, antiviral, antifúngica, antisséptica, anti-inflamatória e cicatrizante.¹⁰10  Hammer KA, Carson CF, Riley TV. Antifungal effects of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and its components on Candida albicans, Candida glabrata and Saccharomyces cerevisiae. J. Antimicrob Chemother. 2004;53(6):1081-5. DOI:10.1093/jac/dkh243^,1515  Mondello F, De Bernardis F, Girolamo A, Cassone A, Salvatore G. In vivo activity of terpinen-4-ol, the main bioactive component of Melaleuca alternifolia Cheel (tea tree) oil against azole-susceptible and -resistant human pathogenic Candida species. BMC Infect Dis. 2006;6:158. DOI:10.1186/1471-2334-6-158 Os monoterpenos oxigenados presentes no óleo essencial da M. alternifolia possuem atividade tóxica sobre larvas de Aedes albopictus com concentração letal (LC₅₀) de 267,13 ppm.⁶6  Conti B, Flamini G, Cioni PL, Ceccarini L, Macchia M, Benelli G. Mosquitocidal essential oils: are they safe against non-target aquatic organisms? Parasitol Res. 2014;113(1):251-9. DOI:10.1007/s00436-013-3651-5

A Carica papaya é da família da Caricaceae, possui ação bactericida e bacteriostática, além de uso como vermífugo, facilitador de digestão, redutor de peroxidação lipídica e antioxidante.¹⁴14  Mello VJ, Gomes MT, Lemos FO, Delfino JL, Andrade SP, Lopes MT, et al. The gastric ulcer protective and healing role of cysteine proteinases from Carica candamarcensis. Phytomedicine. 2008;15(4):237-44. DOI:10.1016/j.phymed.2007.06.004 O extrato alcoólico da folha do C. papaya possui atividade larvicida, ovicida e repelente contra Aedes aegypti.⁹9  Govindarajan M. Bioefficacy of Cassia fistula Linn. (Leguminosae) leaf extract against chikungunya vector, Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2009;13(2):99-103.

Isoladamente, todos os componentes do composto estudado possuem atividade larvicida, mas quando associados em um único produto não há estudo sobre sua eficácia.

Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do composto de óleos essenciais de Azadirachta indica, Melaleuca alternifolia, Carapa guianensis e extrato fermentado de Carica papaya sobre larvas de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae).

MÉTODOS

O composto de óleos essenciais e extrato fermentado é um produto comercial obtido junto à Gued S Biotecnologia^®. Possui a seguinte formulação: óleo essencial da semente da Azadirachta indica 1,0%, óleo essencial do fruto da Melaleuca alternifolia 0,3%, óleo essencial da Carapa guianensis 1,0%, extrato fermentado bacteriano do fruto da Carica papaya 5,0%.

O composto de óleos essenciais e extrato fermentado é imiscível em água e forma uma película na superfície do recipiente que pode causar a morte das larvas por asfixia. Foi necessário diluí-lo em um solvente orgânico, que possibilitasse sua mistura com a água, o dimetil sulfóxido. Este foi testado separadamente para analisar sua ação tóxica sobre as larvas de Aedes aegypti.

As colônias de Aedes aegypti linhagem Liverpool foram estabelecidas a partir de linhagens existentes no insetário do Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais Domésticos da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, 2013. A sua manutenção foi realizada em sala climatizada com temperatura de 28°C (DP = 1), 80,0% (DP = 5,0) de umidade relativa do ar e ciclo natural de foto período 12/12h.

Cubas plásticas contendo dois litros de água declorada foram utilizadas para a eclosão das larvas. As larvas foram alimentadas com ração moída industrializada para gatos.

O ensaio toxicológico seguiu a metodologia preconizada pela OMS.¹¹11  Jang YS, Kim MK, Ahn YS, Lee HS. Larvicidal activity of Brazilian plant against Aedes aegypti and Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Agri Chem Biotechnol. 2002;45(3):131-4.^,3131  World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. Geneva; 1970. (Technical Report Series, 443). Trezentas larvas foram capturadas e transferidas para recipiente descartável contendo 50 mL de água declorada (26°C a 28ºC) ao atingirem o terceiro estádio larval. Cada teste foi realizado em triplicata, com 900 larvas para cada grupo experimental, totalizando 7.200 espécimes. As larvas foram expostas às soluções durante 24h, monitoradas a cada 60 min. As larvas sobreviventes ao ensaio larvicida ficaram em observação até sua emergência para pupa e adulto. Os parâmetros comportamentais das larvas foram observados durante o período experimental para verificar alterações, como: movimento estereotipado, aglomerações, agitação, letargia, mudança de coloração, perda de exúvia e morte.

Os grupos experimentais tiveram a seguinte distribuição: tratados com composto de óleos essenciais de A. indica, M. alternifolia, C. guianensis e extrato fermentado bacteriano de C. papaya nas concentrações de 50,0% (G1), 25,0% (G2) e 12,5% (G3), controle positivo com larvicida industrial Bacillus thuringiensis sorovar israelensis (BTI) nas concentrações de CL₉₀ 0,37 ppm (CP1) e CL₅₀ 0,06 ppm (CP2), controle negativo com água declorada (CN1) e controle negativo com dimetil sulfóxido (CN2).

Os dados de eficácia do composto foram expressos por meio da estatística descritiva de tendência de centralidade e dispersão (média e desvio padrão). Foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com post-hoc de Dunn, a fim de analisar a significância entre os resultados e quais grupos diferiram entre si. O teste não paramétrico do Qui-quadrado (χ²) foi utilizado nas análises referentes ao comportamento das larvas durante o período de 24h. O programa computacional GraphPad Software, Inc., 2000 foi utilizado para tais análises com nível de significância de 0,05.

RESULTADOS

Observaram-se alterações no comportamento das larvas com p < 0,05 nos grupos tratados G1, G2 e G3 durante o teste de atividade larvicida, quando comparadas aos grupos CN1 e CN2, 60 min após a exposição ao composto. Houve diminuição gradativa dos movimentos, aglomeração e estado de letargia, permanecendo imóveis ao estímulo do toque após três horas. As larvas dos grupos controle positivo CP1 e CP2 ficavam letárgicas após duas horas de exposição, permanecendo inertes ao estímulo ao toque e com a cápsula cefálica rígida e escura (Tabela).

As larvas dos grupos controle negativo CN1 e CN2 foram alimentadas e tiveram seu desenvolvimento em pupas e adultos até as 72h pós-experimentação. Entretanto, as larvas sobreviventes dos grupos G1 e G2 tiveram ausência na liberação de exúvia e inibição do desenvolvimento para pupas e adultos durante 21 dias de exposição. Os compostos nas concentrações de 50,0% e 25,0% inibiram seus desenvolvimentos.

As larvas dos grupos tratados com o composto (G1, G2 e G3) apresentaram taxa de mortalidade de 65,0%, 50,0% e 78,0%, respectivamente, nas primeiras dez horas de exposição, enquanto o controle positivo (CP1 e CP2) apresentou taxa significativa de mortalidade de 100%, com p < 0,05, em relação a CN1 e CN2. Houve mortalidade das larvas em todos os grupos tratados. No entanto, o grupo tratado que obteve melhor eficácia ao final de 24h foi o G3, em que houve mortalidade de 100% das larvas, semelhante aos grupos CP1 e CP2.

Larvas dos grupos controle negativo com água (CN1) e dimetil sulfóxido (CN2) não tiveram mortalidade durante 24h de exposição. O dimetil sulfóxido utilizado na diluição do composto não promoveu mortalidade no grupo CN2, indicando que ele não influenciou no desenvolvimento larval ou na morte das larvas nos grupos tratados G1, G2 e G3.

A larva de A. aegypti foi susceptível ao composto de óleos essenciais de A. indica, M. alternifolia e C. guianensis e extrato fermentado de C. papaya, principalmente na concentração de 12,5%.

DISCUSSÃO

O composto de óleos essenciais e extrato fermentado bacteriano possui substâncias ativas hidrossolúveis capazes de atuar como larvicida de larvas de terceiro estádio de Aedes aegypti população Liverpool. A utilização de produtos com baixa toxicidade, pouca contaminação ambiental e elevada eficiência são os preferidos em estudos de controle larval de culicídeos.⁵5  Caser CRS, Carlos GA, Gasperazzo W, Cruz ZMA, Silva AG. Atividade biológica das folhas secas de Neem, Azadirachta indica, sobre larvas de Aedes aegypti. Natureza on line [Internet]. 2007 [citado 2014 mar 28];5(1):19-24. Disponível em: http://www.naturezaonline.com.br/natureza/conteudo/pdf/03_CaserCRSetal_1924.pdf
http://www.naturezaonline.com.br/naturez... ^,2424  Resende MC, Gama RA. Persistência e eficácia do regulador de crescimento pyriproxyfen em condições de laboratório para Aedes aegypti. Rev Soc Bras Med Trop. 2006;39(1):72-5. DOI:10.1590/S0037-86822006000100014

A diminuição dos movimentos larvais é o primeiro sinal de um produto com atividade larvicida.²⁶26  Ruiz LM, Segura C, Trujillo J, Orduz S. In vivo binding of the Cry11bB toxin of Bacillus thuringiensis subsp. medellin to the midgut of mosquito larvae (Diptera: Culicidae). Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004;99(1):73-9. DOI:10.1590/S0074-02762004000100013 Arruda et al³3  Arruda W, Oliveira GMC, Silva IG. Toxicidade do extrato etanólico de Magonia pubescens sobre larvas de Aedes aegypti. Rev Soc Bras Med Trop. 2003;36(1):17-25. DOI:10.1590/S0037-86822003000100004 mostraram que larvas de A. aegypti tiveram redução dos movimentos ao serem tratadas com Magonia pubescens. Essa redução foi observada em larvas de A. aegypti, Culex quinquefasciatus e Anopheles albimanus quando expostas ao BTI.²⁶26  Ruiz LM, Segura C, Trujillo J, Orduz S. In vivo binding of the Cry11bB toxin of Bacillus thuringiensis subsp. medellin to the midgut of mosquito larvae (Diptera: Culicidae). Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004;99(1):73-9. DOI:10.1590/S0074-02762004000100013

O óleo essencial da A. indica tem como príncipio ativo a azadiractina, que tem ação larvicida sobre A. Aegypti e é reportada como causadora de alterações fisiológicas irreversíveis.⁷7  Dua VK, Pandey AC, Raghavendra K, Gupta A, Sharma T, Dash AP. Larvicidal activity of neem oil (Azadirachta indica) formulation against mosquitoes. Malaria J. 2009;8:124. DOI:10.1186/1475-2875-8-124 Ndione et al¹⁹19  Ndione RD, Faye O, Ndiaye M, Dieye A, Afoutou JM. Toxic effects of neem products (Azadirachta indica A. Juss) on Aedes aegypti Linnaeus 1762 larvae. Afr J Biotechnol. 2007;6(24):2846-54. pesquisaram a ação larvicida do óleo da A. indica constataram mortalidade de 64,0% das larvas de quarto estádio de A. aegypti na concentração de 8 mg/L (1,0%), e 82,0% das larvas quando a concentração foi reduzida para 3 mg/L (0,3%) em 24h de exposição. Esse dado apresentou o melhor desempenho larvicida no grupo G3 tratado com a menor concentração do composto.

Larvas de A. aegypti expostas a A. indica têm seu desenvolvimento comprometido. A azadiractina bloqueia a síntese e liberação de ecdisona,¹³13  Macías FA, Oliveros-Bastidas A, Marín D, Carrera C, Chinchilla N, Molinillo JMG. Plant biocommunicators: their phytotoxicity, degradation studies and potential use as herbicide models. Phytochemistry Rev. 2008;7(1):179-94. DOI:10.1007/s11101-007-9062-4 impede a liberação da exúvia e deteriora a cutícula,¹1  Aliero BL. Larvaecidal effects of aqueous extracts of Azadirachta indica (neem) on the larvae of Anopheles mosquito. Afr J Biotechnol. 2003;2(9):325-7. além de bloquear os receptores proteicos do ecditeroide. Isso ocasiona a inibição do crescimento, má formação, esterilidade e morte das larvas.¹⁶16  Murugan K, Hwang JS, Kovendan K, Kumar KP, Vasugi C, Kumar AN. Use of plant products and copepods for control of the dengue vector, Aedes aegypti. Hydrobiologia. 2011;666(1):331-8. DOI:10.1007/s10750-011-0629-0^,2929  Tateishi K, Kiuchi M, Takeda S. New cuticle formation and moult inhibition by RH- 5849 in the common cutworm, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Appl Entomol Zool. 1993;28(2):177-84.

Silva et al²⁸28  Silva OS, Prophiro JS, Nogared JC, Kanis L, Emerick S, Blazius RD, Romão PRT. Larvicidal effect of andiroba oil, Carapa guianensis (Meliaceae), against Aedes aegypti. J Am Mosq Control Assoc. 2006;22(4):699-701. estudaram a ação larvicida da C. guianensis sobre todos os estádios larvais de A. aegypti, colônia Rockefeller e constataram: que a CL₉₀ e a CL₉₅ foram de 164 ppm e 182 ppm após 48h para o primeiro estádio; de 212 ppm e 224 ppm para o segundo estádio; de 210 ppm e 226 ppm para o terceiro estádio; de 450 ppm e 490 ppm para o quarto estágio, respectivamente.⁸8  Emerick S, Prophiro J, Rossi J, et al. Resultados preliminares do efeito larvicida do óleo de andiroba (Carapa guianensis) (Meliacea) em mosquitos do gênero Culex (Diptera: Culicidae). Rev Soc Bras Med Trop. 2005;41:44-45. Larvas de terceiro e quarto estádio de Aedes albopictus, Culex e A. aegypti também tiveram mortalidade com a utilização do óleo dessa planta em diferentes diluições.²⁵25  Rossi JCN, Prophiro JS, Pedroso MF, Torquato MF, Emerick TV, Mendes S, et al. Uso do óleo de andiroba (Carapa guianensis - Meliaceae) como larvicida de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Rev Soc Bras Med Trop. 2005;41:78.^,2727  Silva OS, Romão PRT, Blazius RD, Prohiro JS. The use of andiroba Carapa guianensis as larvicide against Aedes albopictus. J Am Mosq Control Assoc. 2004;20(4):456-7.

A Melaleuca spp. possui várias espécies com atividade larvicida contra A. aegypti, dentre elas a Melaleuca linariifolia, M. dissitiflora e a M. quinquenervia, cujos óleos essenciais obtiveram mais de 80,0% de mortalidade na concentração de 0,1 mg/mL em 48h de exposição.²¹21  Park HM, Kim J, Chang KS, Kim BS, Yang YJ, Kim GH, et al. Larvicidal activity of Myrtaceae essential oils and their components against Aedes aegypti, acute toxicity on Daphnia magna, and aqueous residue. J Med Entomol. 2011;48(2):405-10. DOI:10.1603/ME10108 No entanto, em estudo larvicida realizado por Amer & Mehlhorn,²2  Amer A, Mehlhorn H. Larvicidal effects of various essential oils against Aedes, Anopheles, and Culex larvae (Diptera, Culicidae). Parasitol Res. 2006;99(4):466-72. DOI:10.1007/s00436-006-0182-3 o óleo da M. quinquenervia causou mortalidade de 30,0% das larvas de terceiro estádio de A. aegypti após 24h de exposição em solução de 50 ppm.

Rawani et al²³23  Rawani A, Haldar KM, Ghosh A, Chandra G. Larvicidal activities of three plants against filarial vector Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae). Parasitol Res. 2009;105(5):1411-7. DOI:10.1007/s00436-009-1573-z testaram os extratos brutos de Carica papaya, Murraya paniculata e Cleistanhus collinus sobre larvas de Culex quinquefasciatus e observaram melhor atividade larvicida na Carica papaya. Isso pode ser justificado pela presença de bioativos de metabólitos secundários de forma isolada ou em associação. Kovendan¹²12  Kovendan K, Murugan K, Kumar AN, Vincent S, Hwang JS. Bioefficacy of larvicidal and pupicidal properties of Carica papaya (Caricaceae) leaf extract and bacterial insecticide, spinosad, against chikungunya vector, Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitol Res. 2012;110(2):669-78. DOI:10.1007/s00436-011-2540-z testou o extrato bruto da folha de C. papaya isoladamente e obteve 92,0% de mortalidade sobre larvas de A. aegypti para a concentração de 500 ppm.

O controle de larvas e adultos de A. aegypti e larvas de Culex quinquefasciatus pelo extrato da semente da C. papaya ocorre devido à inibição da amilase, que reduz o tempo de vida e a fecundidade dos adultos, além de promover a mortalidade das larvas.²⁰20  Nunes NNS, Santana LA, Sampaio MU, Lemos FJA, Oliva ML. The component of Carica papaya seed toxic to A. aegypti and the identification of tegupain, the enzyme that generates it. Chemosphere. 2013;92(4):413-20. DOI:10.1016/j.chemosphere.2012.12.078^,2323  Rawani A, Haldar KM, Ghosh A, Chandra G. Larvicidal activities of three plants against filarial vector Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae). Parasitol Res. 2009;105(5):1411-7. DOI:10.1007/s00436-009-1573-z

Como nos estudos individuais anteriormente mencionados, neste artigo a atividade larvicida manteve-se mesmo com a associação dos óleos e extrato fermentado em baixas concentrações, encontradas no produto comercial puro, a saber: 1 mL possui 0,01 mg/L de A. indica, 0,003 mg/L de M. alternifolia, 0,01 mg/L de C. guianensis e 0,05 mg/L de C. papaya. Essa concentração está abaixo das encontradas nos periódicos indexados com as substâncias isoladas, mesmo no composto puro, sem diluição. Assim, houve manutenção da eficácia larvicida.

Em conclusão, a associação dos óleos essenciais da A. indica, M. alternifolia, C. guianensis e extrato fermentado bacteriano da C. papaya atuou em sinergismo em todas as concentrações como larvicida de Aedes aegypti, população Liverpool, nas condições empregadas laboratorialmente. É necessário avaliar esse composto contra A. aegypti de populações de campo e em larvas de outros estádios.

Referências bibliográficas

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