RESUMEN

Con el objetivo de caracterizar molecularmente aislamientos rickettsiales procedentes de humanos con síndrome febril agudo inespecífico se realizó un estudio descriptivo transversal, con aislamientos propagados en cultivos celulares Vero ATCC y líneas alternativas, verificando viabilidad mediante Inmunofluoresencia Indirecta (IFI). Previa extracción del ADN, se amplificó el gen gltA mediante PCR convencional, y se analizó su secuencia. Doce aislamientos fueron amplificados, cinco con suficiente ADN para secuenciarlos, evidenciando compatibilidad con R. asembonensis en cuatro, y estrecha identidad con Coxiella burnetti en uno. Al menos tres de siete líneas celulares alternativas mostraron rendimiento significativo en sub cultivos. Se identificó R. asembonensis en cuatro aislamientos de humanos con síndrome febril agudo inespecífico, procedentes de las regiones de Ayacucho, Cajamarca y Madre de Dios en Perú, y Coxiella burnetti en uno procedente de la región Loreto.

Palabras clave:
Rickettsia; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Perú

ABSTRACT

With the objective of molecularly characterizing rickettsial isolates from humans with non-specific acute febrile syndrome, a cross-sectional descriptive study was conducted, with isolates propagated in Vero ATCC cellular cultures and alternative lines, verifying the viability by means of Indirect Immunofluorescence. Prior to DNA extraction, the gltA gene was amplified by means of conventional PCR, and its sequence was analyzed. Twelve isolates were amplified, five with sufficient DNA so as to sequence them, exhibiting compatibility with R. asembonensis in four, and a close identity with Coxiella burnetti in one. At least three of seven alternative cellular lines showed significant yield in sub-cultures. R. asembonensis was identified in four isolates of humans with non-specific acute febrile syndrome, coming from the regions of Ayacucho, Cajamarca, and Madre de Dios in Peru, and Coxiella burnetti in one coming from the Loreto region.

Keywords:
Rickettsia; Polymerase Chain Reaction; Peru

INTRODUCCIÓN

El síndrome febril agudo inespecífico (SFAI) ocurre frecuentemente en Perú. Un grupo involucrado, aunque con relativamente baja prevalencia, pero significativa trascendencia, son las Rickettsias, una de las zoonosis más antiguas conocidas y un paradigma ideal para entender las infecciones emergentes y re emergentes, en especial las asociadas a transmisión por vectores. Por mucho tiempo, la mayor parte de especies rickettsiales eran consideradas no patogénicas, pero recientemente a raíz del empleo de técnicas moleculares y procedimientos de cultivo celular para aislamiento y caracterización, se detectan en todo el mundo Rickettsias asociadas con infecciones humanas y también especies nuevas de patogenicidad desconocida ¹1. Parola P, Paddock CD, Socolovschi C, Labruna MB, Mediannikov O, Kernif T, et al. Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach. Clin Microbiol Rev. 2013;26(4):657-702. doi: 10.1128/CMR.00032-13.
https://doi.org/10.1128/CMR.00032-13... .

El género Rickettsia pertenece a la Clase α-Proteobacteria, Orden Rickettsiales; Familia Rickettsiaceae. Son pequeñas bacterias cocobacilares gram negativas, estrictamente intracelulares. Son transmitidas a través de ectoparásitos como pulgas, piojos, garrapatas o ácaros. Se ha propuesto su clasificación en base al análisis filogenético detallado de características genéticas y antigénicas de aproximadamente 20 especies, en cuatro grupos: Grupo Ancestral (Rickettsia bellii y Rickettsia canadensis; asociado con garrapatas); Grupo Tifus (R. prowazeckii y R.typhi; asociado con piojos y pulgas respectivamente); Grupo Fiebres Manchadas (R.rickettsii, Rickettsia parkeri, Rickettsia rhipicephali, Rickettsia honei, entre otras, siendo el más numeroso, todas asociadas con garrapatas) y Grupo Transicional (Rickettsia akari, Rickettsia australis y Rickettsia felis; asociado con garrapatas, pulgas y ácaros) ²2. Sahni SK, Narra HP, Sahni A, Walker DH. Recent molecular insights into rickettsial pathogenesis and immunity. Future Microbiol. 2013;8(10):1265-88. doi: 10.2217/fmb.13.102.
https://doi.org/10.2217/fmb.13.102... .

Las principales manifestaciones clínicas del síndrome rickettsial en humanos incluyen fiebre, rash y presencia de escara, y pueden producirse combinaciones; no obstante, no son patognomónicas ³3. Faccini-Martínez ÁA, García-Álvarez L, Hidalgo M, Oteo JA. Syndromic classification of rickettsioses: An approach for clinical practice. Int J Infect Dis. 2014;28:126- 39. doi: 10.1016/j.ijid.2014.05.025.
https://doi.org/10.1016/j.ijid.2014.05.0... . En Perú, por evidencia serológica ⁴4. Anaya-Ramirez E, Palacios-Salvatierra R, Mosquera P, Álvarez C, Peralta C, Gonzales R, et al. Prevalencia de anticuerpos a Rickettsias y Ehrlichias en cuatro departamentos fronterizos del Perú. Rev Peru Med Exp Salud Pública. 2017;34(2):268-272. doi: 10.17843/rpmesp.2017.342.1812.
https://doi.org/10.17843/rpmesp.2017.342... se reconoce a la enfermedad causada por Rickettsias similar a SFAI, mayormente sin rash ni escara. Las especies patogénicas circulantes en la actualidad son prácticamente desconocidas por la escasez de estudios para caracterizar molecularmente aislamientos. Resulta importante dilucidar la participación de especies patogénicas antiguas y nuevas de Rickettsias durante casos o brotes de SFAI, para el diagnóstico diferencial con otras zoonosis virales o bacterianas prevalentes, asociadas a transmisión por vectores, tales como dengue, leptospirosis entre otras. El objetivo del presente estudio es caracterizar molecularmente los aislamientos rickettsiales procedentes de humanos en Perú.

EL ESTUDIO

Se realizó un estudio descriptivo, transversal que incluyó aislados rickettsiales crio preservados obtenidos de muestras sanguíneas humanas con diagnóstico de SFAI, que llegaron al Laboratorio de Metaxénicas Bacterianas del Instituto Nacional de Salud durante 2009 al 2012. Fueron incluidos aislados positivos por IFI, crio preservados a -80° C, no contaminados y con ADN exitosamente amplificados.

Los aislados fueron propagados en cultivo celular Vero (riñón de Cercopithecus aethiops ATCC CCL-81), de bajo pasaje y también empleando los siguientes cultivos celulares alternativos: DH-82 (macrófagos de Canis familiaris ATCC CRL-10389), C6/36 (estadio larval de Aedes albopictus ATCC CRL-1660), J774A-1 (macrófagos de sarcoma de células reticulares de Mus musculus), THP-1 (monocitos de leucemia aguda de Homo sapiens). Además de cultivos secundarios de piel humana (queratinocitos y fibroblastos) a fin de evaluar sensibilidad a desarrollo de Rickettsias in vitro. La viabilidad de los subcultivos fue verificada por IFI ⁵5. Oteo JA, Nava S, Sousa R, Mattar S, Venzal JM, Abarca K, et al. Latinamerican guidelines of RIICER for diagnosis of tick-borne rickettsioses. Rev Chilena Infectol. 2014;31(1):54-65. doi: 10.4067/S0716-10182014000100009.
https://doi.org/10.4067/S0716-1018201400... . Cada aislado fue propagado en al menos una de siete líneas celulares, ejecutando máximo siete sub cultivos en condiciones de bioseguridad nivel II ⁶6. La Scola B, Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases. J Clin Microbiol. 1997; 35(11):2715-27..

Se extrajo en pool ADN bacteriano de cada aislamiento cosechado, luego fue cuantificado en espectrofotómetro y amplificado mediante PCR convencional empleando oligonucleótidos específicos para región objetivo del gen gltA⁷7. Santibañez S, Portillo A, Santibáñez P, Palomar AM, Oteo JA. Usefulness of rickettsial PCR assays for the molecular diagnosis of human rickettsioses. Enferm Infecc y Microbiol Clin. 2013; 31(5): 283- 288.. Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados en ambas hebras ADN con Kit BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) en termociclador modelo Veriti (Applied Biosystems) siguiendo protocolos estandarizados para tiempo, temperatura de incubación y ciclos ⁸8. Blair PJ, Jiang J, Schoeler GB, Moron C, Anaya E, Cespedes M, et al. Characterization of spotted fever group rickettsiae in flea and tick specimens from northern Peru. J Clin Microbiol. 2004; 42(11): 4961-4967.. Los productos del secuenciamiento fueron purificados utilizando columnas Centrisep; eluidos, secados al vacío y sus sedimentos suspendidos en formamida ultra pura, denaturando a 90° C durante 3 min y colocando inmediatamente en hielo. Los productos finales fueron colocados en secuenciador automático de capilares 3500XL (Applied Biosystems). Los datos fueron procesados mediante Blastn 2.0.

El estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación del Instituto Nacional de Salud.

RESULTADOS

Fueron procesadas 4395 muestras de sangre humana de diferentes regiones del territorio peruano. De las que se extrajo leucocitos para aislar Rickettsias en cultivos celulares, varias de ellas de áreas endémicas como Loreto, Cusco, Cajamarca, Piura, Madre de Dios, Ayacucho, entre otras. Después de cultivarlos, la muestra de positivos fue 117 aislamientos crio preservados. Tomando en cuenta pérdidas por contaminación y no propagación exitosa, 97 fueron la muestra final. En la Tabla 1 se presentan los resultados de la reactivación de aislamientos realizados en líneas celulares y en líneas secundarias según categorías positivos fuertes, débiles y negativos, exhibiendo una distribución normal de frecuencias.

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Tabla 1
Líneas celulares utilizadas en la propagación de aislados y número de sub cultivos

Producto de la corrida de la prueba PCR para gen gltA, resultaron positivos doce aislados, sólo cinco de ellos con suficiente ADN para ser secuenciados. Del análisis molecular de estos cinco aislados secuenciados provenientes de Ayacucho, Cajamarca y Madre de Dios, se obtuvo 100% y 99,7% de identidad en secuencias con Rickettsia asembonensis. Un aislado procedente de Loreto mostró 100% de identidad con Coxiella burnetti (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Se reporta el hallazgo de Rickettsia asembonensis en casos de humanos con SFAI en Perú. Estudios previos habían demostrado su alta prevalencia en pulgas, a diferencia de lo que sucede con Rickettsia felis, especie probadamente patogénica para humanos, pero con baja prevalencia en pulgas ⁹9. Jiang J, Maina AN, Knobel DL, Cleaveland S, Laudisoit A, Wamburu K, et al. Molecular detection of Rickettsia felis and Candidatus Rickettsia Asemboensis in Fleas from Human Habitats, Asembo, Kenya. Vector Borne Zoonotic Dis. 2013;13(8):550-8. doi: 10.1089/vbz.2012.1123.
https://doi.org/10.1089/vbz.2012.1123... .

Muchas Rickettsias actualmente reconocidas como patógenas para humanos, fueron primero identificadas en artrópodos ectoparásitos, generalmente garrapatas. Años o décadas después se demostró de manera concluyente la asociación con enfermedad humana. Ocho de trece especies o sub especies de Rickettsias del Grupo Fiebres Manchadas fueron confirmadas como patógenas recién desde 1984 ¹⁰10. Raoult Didier, Parola Philippe. Rickettsial Diseases, 2007. Infectious Disease and Therapy Book 43. CRC Press; 1st ed, Ed. Kindle; 379 pags..

Poder obtener un aislamiento de Rickettsias puede demorar bastante tiempo, porque es reconocido que son microorganismos dificultosos de ser cultivados y propagados ¹¹11. Richards AL. Worldwide detection and identification of new and old rickettsiae and rickettsial diseases. FEMS Immunol Med Microbiol. 2012;64(1):107-10. doi: 10.1111/j.1574-695X.2011.00875.x.
https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2011... , especialmente cuando proceden de muestras clínicas primarias de sangre de pacientes con SFAI, con mínima carga microbiana, y más aún cuando son obtenidas fuera del periodo óptimo para aislamiento o durante tratamiento antibiótico ⁶6. La Scola B, Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnosis of old and new rickettsial diseases. J Clin Microbiol. 1997; 35(11):2715-27.. Esto es lo que ha constituido una limitante para nuestro estudio, tener que hacer múltiples sub cultivos de reactivación y propagación para cada uno de los aislamientos.

Para diagnóstico rápido de infecciones de este tipo, en que el aislamiento en cultivo se demora y dificulta, han resultado muy útiles las pruebas moleculares con iniciadores específicos para identificar productos amplificados. Sin embargo, es necesario interpretar con precaución los resultados obtenidos ¹²12. Fénollar F, Raoult D. Molecular genetic methods for the diagnosis of fastidious microorganisms. APMIS. 2004;112(11- 12):785-807..

El aislamiento de Candidatus Rickettsia asemboensis ha sido previamente reportado, únicamente en ectoparásitos ⁹9. Jiang J, Maina AN, Knobel DL, Cleaveland S, Laudisoit A, Wamburu K, et al. Molecular detection of Rickettsia felis and Candidatus Rickettsia Asemboensis in Fleas from Human Habitats, Asembo, Kenya. Vector Borne Zoonotic Dis. 2013;13(8):550-8. doi: 10.1089/vbz.2012.1123.
https://doi.org/10.1089/vbz.2012.1123... ^,1313. Oteo JA, Portillo A, Portero F, Zavala-Castro J, Venzal JM, Labruna MB. "Candidatus Rickettsia asemboensis" and Wolbachia spp. in Ctenocephalides felis and Pulex irritans fleas removed from dogs in Ecuador. Parasit Vectors 2014;7:455. Doi:10.1186/s13071-014-0455-0
https://doi.org/10.1186/s13071-014-0455-...

14. Jima DD, Luce-fedrow A, Yang Y, Maina AN, Snesrud EC, Otiang E, et al. Strain NMRCii , Isolated from Fleas of Western Kenya. Genome Announc. 2015;3(2). pii: e00018-15. doi: 10.1128/genomeA.00018-15.
https://doi.org/10.1128/genomeA.00018-15... ^-1515. Maina AN, Luce-Fedrow A, Omulo S, Hang J, Chan TC, Ade F, et al. Isolation and characterization of a novel Rickettsia species (Rickettsia asembonensis sp. nov.) obtained from cat fleas (Ctenocephalides felis). Int J Syst Evol Microbiol. 2016;66(11):4512-4517. doi: 10.1099/ijsem.0.001382.
https://doi.org/10.1099/ijsem.0.001382... . Fue encontrada en Carolina del Sur (EE. UU.) en 2009, Egipto en 2006 y 2007, Hungría en 2010, Senegal en 2012, Himalaya en 2015 y Kenia en 2016, siendo referida con dicha denominación al haber sido encontrada infectando pulgas C. felis colectadas en Asembo ⁹9. Jiang J, Maina AN, Knobel DL, Cleaveland S, Laudisoit A, Wamburu K, et al. Molecular detection of Rickettsia felis and Candidatus Rickettsia Asemboensis in Fleas from Human Habitats, Asembo, Kenya. Vector Borne Zoonotic Dis. 2013;13(8):550-8. doi: 10.1089/vbz.2012.1123.
https://doi.org/10.1089/vbz.2012.1123... . Igual que R. felis, también R. asembonensis tiene gen ompA, codificando proteínas auto transportadoras rOmpA en superficie, preservadas en el Grupo Fiebre Manchada. Entonces, las células infectadas exhiben antígenos en superficie, reaccionando por IFI con Suero Anti Grupo Fiebre manchada, alto contra R. parkeri y en menor grado con anti-Grupo Tifus, alto contra R. typhi.

Mediante caracterización genotípica de cinco secuencias de genes rickettsiales (rrs, gltA, ompA, ompB, y sca4) la cepa NMRCiiT fue identificada como Rickettsia y clasificada como especie novel con estrecha relación filogenética con Rickettsia felis. Es bacteria intracelular obligada de crecimiento aeróbico en línea celular de Aedes albopictus (C6/36) a 25° C en medio suplementado con 5% de suero bovino fetal inactivado por calor. El tamaño del genoma completo es de 1,46 Mb y 32,28 moles % de guanina y citosina (G+C) ¹⁵15. Maina AN, Luce-Fedrow A, Omulo S, Hang J, Chan TC, Ade F, et al. Isolation and characterization of a novel Rickettsia species (Rickettsia asembonensis sp. nov.) obtained from cat fleas (Ctenocephalides felis). Int J Syst Evol Microbiol. 2016;66(11):4512-4517. doi: 10.1099/ijsem.0.001382.
https://doi.org/10.1099/ijsem.0.001382... .

En Brasil se le ha descrito infectando garrapatas R. sanguineus, y ha sido denominadaRickettsia asembonensis cepa KX196267 ¹⁶16. Silva AB, Vizzoni VF, Costa AP, Costa FB, Moraes-Filho J, Labruna MB, et al. First report of a Rickettsia asembonensis related infecting fleas in Brazil. Acta Tropica. 2017;172:44-49. doi: 10.1016/j.actatropica.2017.04.004.
https://doi.org/10.1016/j.actatropica.20... , relacionada con pulgas C. felis infectadas. Existen reportes de resultados PCR positivos para los genes gltA, ompB y 16S rRNA en pulgas en Colombia, donde las secuencias presentan alta identidad (98,5%, 97,4% y 99,2%, respectivamente para cada gen) con R. felis, y demuestran 99.7% y 100% de identidad con gltA y ompB de Candidatus Rickettsia asemboensis¹⁷17. Faccini-Martínez AA, Ramírez-Hernandez A, Forero-Becerra E, Cortés-Vecino JA, Escandón P, Rodas JD, et al. Molecular evidence of different Rickettsia species in Villeta, Colombia. Vector Borne Zoonotic Dis. 2016;16(2):85-7. doi: 10.1089/vbz.2015.1841.
https://doi.org/10.1089/vbz.2015.1841... . Por otro lado, alta homología de secuencias de C. felis con Ca. R. asemboensis, concuerda con recientes hallazgos en pulgas colectadas de perros en Ecuador ¹³13. Oteo JA, Portillo A, Portero F, Zavala-Castro J, Venzal JM, Labruna MB. "Candidatus Rickettsia asemboensis" and Wolbachia spp. in Ctenocephalides felis and Pulex irritans fleas removed from dogs in Ecuador. Parasit Vectors 2014;7:455. Doi:10.1186/s13071-014-0455-0
https://doi.org/10.1186/s13071-014-0455-... , siendo necesario complementar la caracterización de especies dentro del grupo Rickettsias de Fiebres Manchadas.

R. asembonensis y R. felis son especies muy relacionadas, pero genéticamente diferentes para considerarlas como especies separadas. Probablemente también R. asembonensis pertenezca al Grupo Transicional como R. felis, que ha sido reclasificada. Se requieren estudios filogenéticos para clasificar el grupo de estas nuevas especies; en consecuencia, R. asembonensis debería estar incluida en futuros estudios filogenéticos de Rickettsia spp. para evaluar su distribución en diferentes regiones geográficas ¹1. Parola P, Paddock CD, Socolovschi C, Labruna MB, Mediannikov O, Kernif T, et al. Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach. Clin Microbiol Rev. 2013;26(4):657-702. doi: 10.1128/CMR.00032-13.
https://doi.org/10.1128/CMR.00032-13... .

Con relación al otro hallazgo, la Coxiella burnetti pertenece a las Gamma Proteobacterias con alto potencial infeccioso para el ganado y animales silvestres. Exhibe características diferentes a Rickettsiae y puede sobrevivir en diversos medioambientes; como en EE. UU. en el 2010 en ambientes con actividad humana, con prevalencias entre 6 hasta 44% sugiriendo que la exposición humana a Coxiella burnetti puede ser más común de lo que indican los reportes de fiebre Q. Además, en la naturaleza existen muchas especies de mamíferos, aves y garrapatas reservorios de C. burnetti¹⁸18. Kersh GJ, Wolfe TM, Fitzpatrick KA, Candee AJ, Oliver LD, Patterson NE, et al. Presence of Coxiella burnetii DNA in the environment of the United States, 2006 to 2008. Appl Environ Microbiol. 2010; 76(13):4469-75. doi: 10.1128/AEM.00042-10.
https://doi.org/10.1128/AEM.00042-10... . Se diferencian de las rickettsias «típicas» en tamaño, naturaleza pleomórfica, resistencia a altas temperaturas y pH bajo, contenido genómico guanina + citosina, forma de proliferación intracelular, vector transmisor y sensibilidad a antibióticos. Puede infectar a humanos vía inhalación de aerosoles, ingestión de carne y leche, contacto con sangre infectada y vectores. La infección es con frecuencia latente en animales, con dispersión persistente.

Nuestro hallazgo requiere investigación adicional tomando en consideración los factores epidemiológicos involucrados, por ser Loreto área de encuentro de diversas poblaciones. Cabe mencionar que fiebre Q puede manifestarse en humanos como enfermedad febril aguda generalmente auto limitada, con neumonía o hepatitis o como enfermedad crónica en pacientes inmunocomprometidos y gestantes. Coxiella burnetii ha sido detectada en garrapatas en la región americana; un reporte de Argentina lo demuestra ¹⁹19. Pacheco RC, Echaide IE, Alves RN, Beletti ME, Nava S, Labruna MB. Coxiella burnetii in ticks, Argentina. Emerg Infect Dis. 2013; 19(2):344-6..

En conclusión, los hallazgos confirman la presencia de especies no reportadas de Rickettsias en humanos durante SFAI en cuatro regiones del territorio peruano durante el periodo 2009 al 2012. Similares estudios en la región confirman la participación rickettsial en la etiología del SFAI ²⁰20. Faccini-Martinez, Ramirez-Hernandez, Barreto C, et al. Epidemiology of Spotted Fever Group Rickettsioses and Acute Undifferentiated Febrile Illness in Villeta, Colombia. Am J Trop Med Hyg. 2017;97(3):782-788. doi: 10.4269/ajtmh.16-0442.
https://doi.org/10.4269/ajtmh.16-0442... . La especie Rickettsia asembonensis ha sido previamente encontrada en Sudamérica, infectando ectoparásitos ²¹21. Kocher C, Morrison AC, Leguia M, Loyola S, Castillo RM, Galvez HA, et al. Rickettsial disease in the Peruvian Amazon Basin. PLoS Negl Trop Dis, 2016; ;10(7):e0004843. doi: 10.1371/journal.pntd.0004843.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000...

22. Palacios-Salvatierra R, Anaya-Ramírez E, Juscamayta-López J, Cáceres-Rey O, Mendoza-Uribe L, Mosquera-Visaloth P. Perfil epidemiológico y molecular de Rickettsiosis en localidades de frontera peruana. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2017;34(1):76-84. doi: 10.17843/rpmesp.2017.341.2769.
https://doi.org/10.17843/rpmesp.2017.341... ^-2323. Loyola S, Flores-Mendoza C, Torre A, Kocher C, Melendrez M, Luce-Fedrow A, et al. Rickettsia asembonensis Characterization by Multilocus Sequence Typing of complete genes, Peru. Emerg Infect Dis. 2018;24(5):931-933. doi: 10.3201/eid2405.170323.
https://doi.org/10.3201/eid2405.170323... , esta sería la primera vez que es aislada de muestras humanas en el mismo periodo de estudio en el que fueron encontradas habitando en ectoparásitos, pero en regiones no reportadas, lo cual amerita vigilancia epidemiológica efectiva y estudios adicionales para caracterización completa de especies circulantes.

Referencias Bibliográficas

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