RESUMEN

Con el objetivo de determinar la diversidad de variantes patogénicas de Vibrio parahaemolyticus en el Perú durante el periodo 1995-2017, se analizaron 102 genomas peruanos (97 clínicos y 5 ambientales) empleando el esquema de tipificación multilocus y BLASTn para la búsqueda de genes de virulencia. Se identificaron 15 tipos de secuencia diferentes, encontrándose que el genotipo ST3, perteneciente al clon pandémico, fue el más abundante, con 52% (n=53); seguido por el ST120, con 23,5% (n=24); y el complejo clonal CC345, con 11,8% (n=12). Un total de 89 cepas analizadas presentaron genes que codifican la isla de patogenicidad VpaI-7 (87,3%), mientras que 96 presentaron el gen tdh (94,1%), y 6, el trh (5,9%). Durante el periodo evaluado, se resalta la predominancia del ST3, causante de un importante brote en el pasado del Perú, además de otros genotipos patógenos que representan un riesgo latente en salud pública asociado al consumo de alimentos marinos.

Palabras clave:
Vibrio parahaemolyticus; Salud Pública; Monitoreo Epidemiológico; Tipificación Molecular; Secuenciación Completa del Genoma

ABSTRACT

During the period from 1995 to 2017, in order to determine the diversity of Vibrio parahaemolyticus pathogenic variants in Peru, 102 Peruvian genomes (97 from a hospital setting and 5 from an out-of-hospital setting) were analyzed using the multilocus typification scheme and BLASTn in the search for virulence genes. Fifteen different sequence types were identified. It was found that the ST3 genotype, which is found in the pandemic clone, was the most abundant, with 52% (n=53); followed by ST120, with 23.5% (n=24); and the CC345 clonal complex, with 11.8% (n=12). A total of 89 analyzed strains presented genes encoding the pathogenicity island VpaI-7 (87.3%), while 96 presented the tdh gene (94.1%), and 6 the trh gene (5.9%). The ST3 genotype was the predominant one during the evaluated period, this genotype was the cause of a major outbreak in Peru’s past history. Other pathogenic genotypes found represent a latent public health risk associated with seafood consumption.

Keywords:
Vibrio parahaemolyticus; Public Health, Epidemiological Monitoring; Molecular Typing; Whole Genome Sequencing

INTRODUCCIÓN

La presencia de bacterias patógenas en el ambiente marino incrementa el interés humano en seguridad alimentaria debido a su potencial para causar brotes. Entre ellas, destaca la Vibrio parahaemolyticus, una bacteria gramnegativa halófila ampliamente distribuida en ecosistemas costeros, cuya serotipificación depende de los antígenos somáticos (O) y capsulares (K) producidos en diversas condiciones ambientales ¹1. Banerjee SK, Kearney AK, Nadon CA, Peterson C-L, Tyler K, Bakouche L, et al. Phenotypic and Genotypic Characterization of Canadian Clinical Isolates of Vibrio parahaemolyticus Collected from 2000 to 2009. J Clin Microbiol. 2014;52(4):1081-8. doi: 10.1128/JCM.03047-13.
https://doi.org/10.1128/JCM.03047-13... .

El interés por la V. parahaemolyticus se inició muchos años atrás, luego de ser agente causante de infecciones transmitidas por alimentos en un brote ocurrido en Japón. Históricamente, la V. parahaemolyticus ha sido responsable del 20-30% de los casos de infección alimentaria en Japón y otros países asiáticos ²2. Alam MJ, Tomochika KI, Miyoshi SI, Shinoda S. Environmental investigation of potentially pathogenic Vibrio parahaemolyticus in the Seto-Inland Sea, Japan. FEMS Microbiol Lett. 2002;208(1):83-7. doi: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11064.x.
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2002... . El Perú ha registrado brotes importantes desde 1997, los cuales han sido asociados a los cambios climáticos que forman parte del fenómeno de El Niño, y que alteran condiciones ecológicas marinas, como el incremento de la tasa de abundancia del plancton³3. Aliaga R, Miranda J, Zevallos J. Aislamiento e identificación de Vibrio parahaemolyticus O3: K6 en pescados y moluscos bivalvos procedentes de un mercado pesquero de Lima, Perú. Rev Medica Hered. 2010;21(3):139-45. doi: 10.20453/rmh.v21i3.1123.
https://doi.org/10.20453/rmh.v21i3.1123... . La mayoría de estos informes asocian a la hemolisina directa termoestable (TDH, por sus siglas en inglés) con la virulencia de la V. parahaemolyticus⁴4. Nair GB, Ramamurthy T, Bhattacharya SK, Dutta B, Takeda Y, Sack DA. Global Dissemination of Vibrio parahaemolyticus Serotype O3:K6 and Its Serovariants. Clin Microbiol Rev. 2007;20(1):39-48. doi: 10.1128/CMR.00025-06.
https://doi.org/10.1128/CMR.00025-06... .

Actualmente, la prevalencia mundial y la emergencia de casos de infección por V. parahaemolyticus van en incremento, subrayando la necesidad de mantener una vigilancia adecuada de este patógeno. La microbiología convencional resulta insuficiente para determinar variantes patógenas y su distribución geográfica. En contraste, herramientas de epidemiología molecular, como el esquema de tipificación multilocus (MLST, por sus siglas en inglés) se proponen como nuevas alternativas que permiten el estudio de enfermedades infecciosas sobre la base de la diferenciación molecular de cepas. Este esquema permite la caracterización genotípica rápida de microorganismos, gracias al desarrollo de una base de datos centralizada (PubMLST) que permite comparar diversas variantes genéticas denominadas tipos de secuencias (ST, por sus siglas en inglés, sequence type,) y delinear rutas potenciales de dispersión⁵5. Gonzalez-Escalona N, Jolley KA, Reed E, Martinez-Urtaza J. Defining a Core Genome Multilocus Sequence Typing Scheme for the Global Epidemiology of Vibrio parahaemolyticus. J Clin Microbiol. 2017;55(6):1682-97. doi: 10.1128/JCM.00227-17.
https://doi.org/10.1128/JCM.00227-17... .

El objetivo del presente estudio fue determinar las variantes genéticas de los aislados patógenos de la V. parahaemolyticus asociadas a casos humanos y alimentos marinos circulantes en el Perú entre 1995-2017, usando la técnica del MLST y detección in silico de genes de virulencia.

EL ESTUDIO

Se incluyeron 16 cepas remitidas como V. parahaemolyticus pertenecientes a la colección del Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud (INS) (Bioproject: PRJNA556706) y 86 genomas peruanos disponibles en la base de datos del NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para el análisis MLST (Tabla 1).

Las cepas fueron recuperadas en agua de peptona alcalina (Merck, Alemania) a 37 °C durante 68 horas. Posteriormente, fueron sembradas por estría en placas de agar tiosulfato citrato bilis esculina (Merck, Alemania), y se incubaron a 37 °C durante 18 a 24 horas. El género Vibrio fue confirmado utilizando pruebas bioquímicas convencionales, y la especie V. parahaemolyticus mediante PCR por la presencia del gen toxR descrito por Kim et al.⁶6. Kim YB, Okuda J, Matsumoto C, Takahashi N, Hashimoto S, Nishibuchi M. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene. J Clin Microbiol. 1999;37(4):1173-7.

La extracción del ADN se realizó utilizando el kit DNeasy Blood &Tissue (Qiagen, Alemania). La concentración y pureza del ADN se evaluaron mediante espectrofotometría (Denovix, EE. UU). La elaboración de bibliotecas de secuenciamiento se realizó con el kit Nextera XT (Illumina, EE. UU), y el secuenciamiento genómico, con el secuenciador de alto rendimiento MiSeq (Illumina, EE. UU)⁷7. Quino W, Hurtado CV, Escalante-Maldonado O, Flores-León D, Mestanza O, Vences-Rosales F, et al. Multidrogorresistencia de Salmonella infantis en Perú: un estudio mediante secuenciamiento de nueva generación. Rev Peru Med Exp Salud Pública. 2019;36(1):37-45. doi: 10.17843/rpmesp.2019.361.3934.
https://doi.org/10.17843/rpmesp.2019.361... . La calidad de las secuencias obtenidas fue evaluada mediante el programa FastQC v0.11.5. Las secuencias se ensamblaron de novo empleando el pipeline A5-miseq⁸8. Coil D, Jospin G, Darling AE. A5-miseq: an updated pipeline to assemble microbial genomes from Illumina MiSeq data. Bioinforma Oxf Engl. 2015;31(4):587-9. doi: 10.1093/bioinformatics/btu661.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/b... . La identificación del género y la detección de contigs contaminados se realizó con el programa Kraken⁹9. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biol. 2014;15(3):R46. doi: 10.1186/gb-2014-15-3-r46.
https://doi.org/10.1186/gb-2014-15-3-r46... .

Los perfiles alélicos y los ST de los genomas obtenidos se asignaron de acuerdo a la información de la base de datos del MLST para V. parahaemolyticus ( ), utilizando el programa MLST v2.10, sobre la base del esquema de siete locus descrito para la V. parahaemolyticus⁵5. Gonzalez-Escalona N, Jolley KA, Reed E, Martinez-Urtaza J. Defining a Core Genome Multilocus Sequence Typing Scheme for the Global Epidemiology of Vibrio parahaemolyticus. J Clin Microbiol. 2017;55(6):1682-97. doi: 10.1128/JCM.00227-17.
https://doi.org/10.1128/JCM.00227-17... . La asignación de complejos clonales se realizó utilizando el programa BioNumerics v7.5 (Applied Maths). La inclusión en un complejo clonal (CC) se restringió a los ST que compartían al menos 6 de los 7 alelos, mientras que los singletons se definieron como ST que difieren en dos o más alelos de los otros STs. Con el mismo programa se generó un minimum spanning tree (MST) que muestra los ST y los CC incluidos en este trabajo. Adicionalmente, se construyó una gráfica de barras apiladas de los aislados estudiados empleando Infostat, para visualizar genotipos por año de aislamiento y por número de muestras.

Se utilizó la herramienta BLASTn para buscar factores de virulencia de la V. parahaemolyticus: la isla de patogenicidad de tipo 7 (VpaI-7) que contiene internamente la variante más común de la TDH obtenida del cromosoma 2 del genoma RIMD 2210633 (número de acceso: NC_004605.1) y la TRH obtenida del aislado AQ4299 (número de acceso: LC271586.1), identificando como homólogos aquellos que presenten <90% de identidad y una cobertura <60% de alineamiento a la referencia. El código empleado para la anotación se encuentra disponible en . Los resultados obtenidos fueron ordenados en formato de tabla en la que se indica la presencia o la ausencia de genes. Todas las secuencias obtenidas durante el estudio han sido depositadas en el GenBank (número de acceso de Bioproject: PRJNA556706).

EL HALLAZGO

Las 16 cepas fueron confirmadas como V. parahaemolyticus por la presencia del gen ToxR. En cuanto a la información genómica, se obtuvo, en promedio, un tamaño genómico de 5,18 pb, compuestas por 80 contigs y un porcentaje de GC de 45,2%.

En total, se analizaron 102 genomas de cepas peruanas de origen clínico (97) y ambiental (5), aisladas en el periodo 1995-2017 (Tabla 1). Los 102 genomas fueron clasificados en 15 ST diferentes, que fueron agrupados por año de aislamiento y origen del aislado (Figura 1). Se observa que no se obtuvieron aislados en los años 2004, 2010 y 2012.

La estructura poblacional de las cepas de la V. parahaemolyticus peruanos (n=102) analizadas por MLST se puede visualizar mediante un MST (Figura 2). Todas las cepas pertenecientes al complejo pandémico O3:K6 se agruparon en el ST3 (n=53), correspondiente al 52% de las cepas analizadas. Además, se identificó el complejo clonal 345 (CC345) compuesto por los ST88 (n=3) y ST265 (n=9), ambas del serotipo O4:K8 que difieren en un solo locus, con una frecuencia de aislamiento de 11,8%. Las cepas restantes se incluyeron en 12 ST no relacionados, resaltando al ST120 23,5% (n=24) y ST36 1,9% (n=2) por estar relacionados con brotes o epidemias a nivel local o global (Anexo 1).

De los 102 genomas analizados, 89 aislados poseían la isla de patogenicidad VpaI-7 (87,3%). Las copias de los genes que codifican la TDH se encontraron en 96 aislados (94,1%), siendo los ST más frecuentes: ST3, ST36, ST88, ST120 y ST265, mientras que los genes de la TRH se encontraron únicamente en los ST36, ST64, ST65 y ST417, dando un total de 6 aislados (5,9%). Los resultados agrupados por ST se pueden visualizar en la Tabla 2, mientras que los resultados por aislado de los genes que componen la VpaI-7 se pueden ver en el Anexo 2.

DISCUSIÓN

V. parahaemolyticus es un patógeno transmitido por alimentos de alto consumo, y, a pesar de ello, se tiene poca información sobre las variantes patogénicas y la prevalencia temporal de sus genotipos en el Perú. Este reporte subestimado de infecciones por V. parahaemolyticus en el ámbito hospitalario se debe a las deficiencias en el monitoreo y la investigación de enfermedades transmitidas por alimentos ¹⁰10. Martinez-Urtaza J, Lozano-Leon A, DePaola A, Ishibashi M, Shimada K, Nishibuchi M, et al. Characterization of Pathogenic Vibrio parahaemolyticus Isolates from Clinical Sources in Spain and Comparison with Asian and North American Pandemic Isolates. J Clin Microbiol. 2004;42(10): 4672-78. doi: 10.1128/JCM.42.10.4672-4678.2004.
https://doi.org/10.1128/JCM.42.10.4672-4... .

Analizando la prevalencia temporal de genotipos detectados, los aislados con mayor antigüedad corresponden a los años 1995-1996, en especial al serotipo O4:K8, pero de genotipos distintos: ST88 y ST265. Estudios previos reportan a este serotipo desde 1980 causando casos esporádicos y pequeños brotes asociado al consumo de alimentos marinos crudos, siendo en 1983 el más prevalente ¹¹11. Gavilan RG, Zamudio ML, Martinez-Urtaza J. Molecular epidemiology and genetic variation of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Peru. PLoS Negl Trop Dis. 2013;7(5):e2210. doi: 10.1371/journal.pntd.0002210.
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.000... . Estudios de vigilancia molecular revelaron a China como el origen de este serotipo, compuesto por diversos genotipos que no tienen relación clonal con el serotipo O3:K6, sugiriéndolo como un importante complejo clonal, CC345. Además, análisis de genómica comparativa revelaron que estos aislados presentaban las regiones del sistema de secreción tipo 3 (T3SS) y la VpaI-7 ¹²12. Li B, Yang X, Tan H, Ke B, He D, Ke C, et al. Vibrio parahaemolyticus O4:K8 forms a potential predominant clone in southern China as detected by whole-genome sequence analysis. Int J Food Microbiol. 2017;244:90-5. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2017.01.001.
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.20... , lo cual es acorde a lo encontrado aquí.

Por otro lado, la presencia del ST3 resalta en la distribución por año y en el MST, al ser el genotipo con mayor número de aislados secuenciados, abarcando cepas aisladas entre 19972017. Todas ellas presentaron la VpaI-7 completa. El primer brote peruano del ST3 se produjo en 1997; sin embargo, se conoce que emergió en la India en 1996 expandiéndose hasta alcanzar el continente americano¹³13. Guerrero A, Lizárraga-Partida ML, Gil BG, Licea-Navarro AF, Revilla-Castellanos VJ, Wong-Chang I, et al. Genetic Analysis of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 Strains That Have Been Isolated in Mexico Since 1998. PLoS ONE. 2017;12(1): e0169722. doi: 10.1371/journal.pone.0169722.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.016... . Este genotipo pertenece al complejo clonal pandémico (CC3) de amplia distribución mundial, siendo el clon dominante hasta hoy⁵5. Gonzalez-Escalona N, Jolley KA, Reed E, Martinez-Urtaza J. Defining a Core Genome Multilocus Sequence Typing Scheme for the Global Epidemiology of Vibrio parahaemolyticus. J Clin Microbiol. 2017;55(6):1682-97. doi: 10.1128/JCM.00227-17.
https://doi.org/10.1128/JCM.00227-17... , además de ser el genotipo más explorado por poseer la mayoría de VpaI reportadas para V. parahaemolyticus, siendo la VpaI-7 la más importante, asociada a citotoxicidad y enterotoxicidad por la presencia de la TDH y el T3SS ¹⁴14. Ceccarelli D, Hasan NA, Huq A, Colwell RR. Distribution and dynamics of epidemic and pandemic Vibrio parahaemolyticus virulence factors. Front Cell Infect Microbiol . 2013;3:97. doi: 10.3389/fcimb.2013.00097.
https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00097... .

El ST120 es el segundo grupo con mayor número de aislados en este estudio, obtenidos mayormente durante el 2009 debido a un brote del serotipo O3:K59 en el norte del país¹⁵15. Zamudio ML, Meza A, Bailón H, Martinez-Urtaza J, Campos J. Experiences in the epidemiological surveillance of foodborne pathogens by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) in Peru. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2011;28(1):128-35., el cual luego de la aplicación de vigilancia molecular por MLST fue definido como ST120, cuyo origen es China, representando la tercera introducción de poblaciones patógenas de V. parahaemolyticus¹⁶16. Gonzalez-Escalona N, Gavilan RG, Toro M, Zamudio ML, Martinez-Urtaza J. Outbreak of Vibrio parahaemolyticus Sequence Type 120, Peru, 2009. Emerg Infect Dis. 2016;22(7):1235-7. doi: 10.3201/eid2207.151896.
https://doi.org/10.3201/eid2207.151896... . En los resultados, llama la atención la presencia de este genotipo durante 2001, muchos años antes de su primer reporte, lo cual permitiría replantear la introducción de este genotipo al Perú. Estudios de genómica comparativa serían necesarios para encontrar diferencias entre estos aislados y los que causaron el brote del 2009, los cuales comparten la presencia de la VpaI-7.

Adicionalmente, el ST36, un grupo pequeño de importancia epidemiológica dentro de los aislados peruanos analizados, tiene su origen en la región noroeste del pacífico de Norteamérica causando brotes en los Estados Unidos y Canadá ¹1. Banerjee SK, Kearney AK, Nadon CA, Peterson C-L, Tyler K, Bakouche L, et al. Phenotypic and Genotypic Characterization of Canadian Clinical Isolates of Vibrio parahaemolyticus Collected from 2000 to 2009. J Clin Microbiol. 2014;52(4):1081-8. doi: 10.1128/JCM.03047-13.
https://doi.org/10.1128/JCM.03047-13... , el cual se ha expandido desde el 2012 hasta alcanzar rápidamente otras áreas geográficas como el noroeste de España ¹⁷17. Martinez-Urtaza J, Aerle RV, Marin MA, Haendiges J, Myers RA, Trinanes J, et al. Genomic variation and evolution of vibrio parahaemolyticus ST36 over the course of a transcontinental epidemic expansion. mBio. 2017;8(6):e01425-17. doi: 10.1128/mBio.01425-17.
https://doi.org/10.1128/mBio.01425-17... . En base a nuestros resultados, las primeras cepas pertenecientes a este ST aparecen en Perú en el 2011, siendo parte de la expansión de este clon en el Pacífico ¹⁸18. Abanto M, Gavilan RG, Baker-Austin C, Gonzalez-Escalona N, Martinez-Urtaza J. Global Expansion of Pacific Northwest Vibrio parahaemolyticus Sequence Type 36. Emerging Infectious Diseases. 2020;26(2):323-6. doi: 10.3201/eid2602.190362.
https://doi.org/10.3201/eid2602.190362... , y aunque no se ha reportado ningún brote de este genotipo, representa un riesgo epidemiológico latente debido a su potencial patogénico por la presencia de la TDH y la TRH. En este aspecto, la vigilancia molecular por MLST puede ser aplicada para el rastreo oportuno de estos aislados y frenar brotes.

En cuanto a los otros ST, no se encontró información que los señale como causantes de brote o de las epidemias alrededor del mundo. Sin embargo, no se descarta su potencial patogénico, debido a la presencia de genes que codifican la TDH o la TRH, resultados que incluyen genotipos como los ST1169 y ST1737.

El análisis de factores de virulencia detectó la presencia de los genes que codifican la TDH en gran parte de aislados clínicos, particularmente en los genotipos con mayor número de aislados analizados. Se conoce que los genes que codifican la TDH mayormente se ubican dentro de la VpaI-7, por lo que la presencia de esta región tendrá un impacto en el incremento de la virulencia de V. parahaemolyticus¹⁹19. Raghunath P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 2015;5:805. doi: 10.3389/fmicb.2014.00805.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00805... ; sin embargo, la deleción genética de las copias del gen tdh o de la VpaI-7 completa no es determinante para la ausencia de virulencia ¹⁴14. Ceccarelli D, Hasan NA, Huq A, Colwell RR. Distribution and dynamics of epidemic and pandemic Vibrio parahaemolyticus virulence factors. Front Cell Infect Microbiol . 2013;3:97. doi: 10.3389/fcimb.2013.00097.
https://doi.org/10.3389/fcimb.2013.00097... , lo que explica la detección de cepas clínicas con ausencia de TDH. Por otro lado, se detectaron genomas con TDH pero sin VpaI-7, lo cual ya fue descrito como variantes TDH no asociadas a VpaI-7 ²⁰20. Okada N, Iida T, Park KS, Goto N, Yasunaga T, Hiyoshi H, et al. Identification and characterization of a novel type III secretion system in trh-positive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity of pathogenic machinery beyond the species level. Infection and immunity. 2009;77(2):904-13. doi: 10.1128/IAI.01184-08.
https://doi.org/10.1128/IAI.01184-08... . Finalmente, el gen que codifica la TRH, el cual causa un efecto similar a la TDH, se encontró en un grupo muy reducido de aislados.

En conclusión, el ST3 predomina tanto temporal como numéricamente en el Perú, por lo que hasta el día de hoy es un genotipo de riesgo en salud pública asociado al consumo de alimentos marinos crudos o semicrudos, destacando su potencial patógeno debido a la presencia de la VpaI-7 portadora de hemolisinas. Esto, sumado a la data epidemiológica subestimada, así como la circulación de otras variantes patógenas de esta bacteria en el país, sugiere incrementar los esfuerzos en la vigilancia molecular, la cual está resultando ser una herramienta poderosa para detectar y controlar brotes e infecciones.

Agradecimientos:

A Gustavo Bellido Mendoza por su incalculable apoyo técnico y a todo el equipo del Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos del Instituto Nacional de Salud por el apoyo brindado durante la realización de este trabajo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Anexo 1.

Introducción y detección de tipo de secuencia según el análisis MLST por año y origen de aislamiento

Fechas de Publicación

Histórico