RESUMEN

Las mitocondrias son organelas complejas que desempeñan un papel fundamental en la célula, la disfunción mitocondrial puede ocasionar daños celulares significativos o la muerte. Estudios previos han demostrado los prometedores efectos terapéuticos del trasplante de mitocondrias autólogas a un tejido cardiaco isquémico, sin embargo, pocos estudios han evaluado los efectos in vivo de la infusión de mitocondrias en el cerebro. El presente trabajo tiene como objetivo dar a conocer el procedimiento para la infusión vía carótida de mitocondrias autólogas en cerebros porcinos. Mediante esta técnica de infusión, proponemos que una administración selectiva y mínimamente invasiva es factible y puede proporcionar beneficios en el tratamiento de diversas patologías del sistema nervioso central.

Palabras clave:
Mitocondria; Microcatéter; Infusión; Carótida; Cerebro; Cerdo

INTRODUCCIÓN

El trasplante mitocondrial se ha realizado como tratamiento terapéutico en cuadros de isquemia cardíaca y lesiones de reperfusión tanto en animales ¹1. McCully JD, Cowan DB, Emani SM, Del Nido PJ. Mitochondrial transplantation: From animal models to clinical use in humans. Mitochondrion. 2017; 34: 127-34. doi: 10.1016/j.mito.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.03.0... como en seres humanos ²2. Emani SM, Piekarski BL, Harrild D, Del Nido PJ, McCully JD. Autologous mitochondrial transplantation for dysfunction after ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 2017; 154: 286-289. doi: 10.1016/j. jtcvs.2017.02.018.
https://doi.org/10.1016/j... . Estos estudios demuestran que la infusión de mitocondrias autólogas, es decir, aisladas del propio tejido del paciente, compensa la disminución o pérdida de la función mitocondrial en células locales dañadas durante la isquemia y mejora la recuperación posisquemia. Estudios preclínicos ¹1. McCully JD, Cowan DB, Emani SM, Del Nido PJ. Mitochondrial transplantation: From animal models to clinical use in humans. Mitochondrion. 2017; 34: 127-34. doi: 10.1016/j.mito.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.03.0... y ensayos de bioseguridad ³3. Shin B, Saeed MY, Esch JJ, Guariento A, Blitzer D, Moskowitzova K, et al. A Novel Biological Strategy for Myocardial Protection by Intracoronary Delivery of Mitochondria: Safety and Efficacy. JACC Basic Transl Sci. 2019; 4: 871-888. doi: 10.1016/j.jacbts.2019.08.007.
https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2019.08... han demostrado que el procedimiento es bien tolerado, sin que se reporte inmunorreactividad ⁴4. Ramirez-Barbieri G, Moskowitzova K, Shin B, Blitzer D, Orfany A, Guariento A, et al. Alloreactivity and allorecognition of syngeneic and allogeneic mitochondria. Mitochondrion. 2019; 46: 103-115. doi: 10.1016/j.mito.2018.03.002.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2018.03.0... , lesiones locales o efectos sistémicos adversos. Actualmente se continúan realizando estudios para comprender el o los mecanismos implicados en la internalización de las mitocondrias extracelulares, su longevidad una vez trasplantados y la cuantificación de sus efectos, entre otros aspectos.

Estudios in vitro⁵5. Hayakawa K, Esposito E, Wang X, Terasaki Y, Liu Y, Xing C, et al. Transfer of mitochondria from astrocytes to neurons after stroke. Nature. 2016;535: 551-555. doi: 10.1038/nature18928
https://doi.org/10.1038/nature18928... ^,66. Liu K, Guo L, Zhou Z, Pan M, Yan C. Mesenchymal stem cells transfer mitochondria into cerebral microvasculature and promote recovery from ischemic stroke. Microvasc Res. 2019; 123: 74-80. doi: 10.1016/j.mvr.2019.01.001.
https://doi.org/10.1016/j.mvr.2019.01.00... y en modelo murino realizando infusión directa de mitocondrias autólogas en la médula espinal y en tejido cerebral han demostrado efectos igualmente positivos para una serie de diferentes afecciones neurológicas como traumatismos ⁷7. Fang SY, Roan JN, Lee JS, Chiu MH, Lin MW, Liu CC, et al. Transplantation of viable mitochondria attenuates neurologic injury after spinal cord ischemia. J Thorac Cardiovasc Surg. 2019; 14: 32775-8. doi: 10.1016/j.jtcvs.2019.10.151.
https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2019.10.... ^,88. Gollihue JL, Patel SP, Eldahan KC, Cox DH, Donahue RR, Taylor BK, et al. Effects of mitochondrial transplantation on bioenergetics, cellular incorporation, and functional recovery after spinal cord injury. J Neurotrauma. 2018; 35: 1800-1818. doi: 10.1089/neu.2017.5605.
https://doi.org/10.1089/neu.2017.5605... , esquizofrenia ⁹9. Robicsek O, Ene HM, Karry R, Ytzhaki O, Asor E, McPhie D, et al. Isolated mitochondria transfer improves neuronal differentiation of schizophrenia-derived induced pluripotent stem cells and rescues de?cits in a rat model of the disorder. Schizophr Bull. 2018; 44: 432-442. doi: 10.1093/schbul/sbx077.
https://doi.org/10.1093/schbul/sbx077... , enfermedad de Parkinson ¹⁰10. Chang JC, Wu SL, Liu KH, Chen YH, Chuang CS, Cheng FC, et al. Allogeneic/xenogeneic transplantation of peptide-labeled mitochondria in Parkinson's disease: restoration of mitochondria functions and attenuation of 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity. Transl Res. 2016; 170: 40-56. doi: 10.1016/j.trsi.2015.12.003.
https://doi.org/10.1016/j.trsi.2015.12.0... e isquemia cerebral ¹¹11. Heyck M, Bonsack B, Zhang H, Sadanandan N, Cozene B, Kingsbury C, et al. The brain and eye: treating cerebral and retinal ischemia through mitochondrial transfer. Exp Biol Med Exp Biol Med (Maywood). 2019; 244: 1485-1492. doi: 10.1177/1535370219881623.
https://doi.org/10.1177/1535370219881623... ^,1212. Zhang Z, Ma Z, Yan C, Pu K, Wu M, Bai J, et al. Muscle-derived autologous mitochondrial transplantation: a novel strategy for treating cerebral ischemic injury. Behav Brain Res. 2019; 356: 322-331. doi: 10.1016/j.bbr.2018.09.005.
https://doi.org/10.1016/j.bbr.2018.09.00... . El trasplante xenogénico también ha mostrado resultados prometedores tras la inyección local intracerebral o intraarterial en cerebros isquémicos de ratas¹³13. Huang PJ, Kuo CC, Lee HC, Shen CI, Cheng FC, Wu SF, et al. Transferring Xenogenic Mitochondria Provides Neural Protection Against Ischemic Stress in Ischemic Rat Brains. Cell Transplant. 2016; 25: 913-27. doi: 10.3727/096368915X689785.
https://doi.org/10.3727/096368915X689785... y en el modelo experimental de Parkinson en ratones ¹⁴14. Shi X, Zhao M, Fu C, Fu A. Intravenous administration of mitochondria for treating experimental Parkinson's disease. Mitochondrion. 2017; 34: 91-100. doi: 10.1016/j.mito.2017.02.005.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.02.0... .

A diferencia del tejido cardíaco, el sistema nervioso central presenta un desafío para el tratamiento de muchas patologías que es lograr el paso de agentes terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) que limita la entrada y absorción de diversas moléculas ¹⁵15. Hawkins BT, Davis TP. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 2005; 57: 173-185. doi: 10.1124/pr.57.2.4.
https://doi.org/10.1124/pr.57.2.4... , sin embargo, diversos cuadros neuropatológicos están asociados a una disrupción de la BHE y a daño tisular ¹⁶16. Alroy KA, Arroyo G, Gilman RH, Gonzales-Gustavson E, Gallegos L, Gavidia CM, et al. Carotid Taenia solium Oncosphere Infection: A Novel Porcine Neurocysticercosis Model. Am J Trop Med Hyg. 2018; 99: 380-387. doi: 10.4269/ajtmh.17-0912.
https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0912... . El aumento de la permeabilidad de la BHE puede lograrse mediante el uso de soluciones hiperosmóticas como el manitol ¹⁷17. Cosolo WC, Martinello P, Louis WJ, Christophidis N. Blood-brain barrier disruption using mannitol: time course and electron microscopy studies. Am J Physiol. 1989; 256: R443-R447. doi: 10.1152/ajpregu.1989.256.2.R443.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1989.256... , poliol de 6 carbonos con actividad diurética, ampliamente utilizado en ensayos clínicos y aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamente (FDA) de los Estados Unidos.

En el presente trabajo, desarrollamos una metodología para la infusión mitocondrial vía carótida al cerebro porcino. Adicionalmente, aumentamos la permeabilidad de la BHE para garantizar el ingreso de las mitocondrias. Concluimos que la infusión con microcatéter es una opción factible para estudiar a futuro el potencial uso terapéutico de la infusión mitocondrial en diversas patologías.

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

Se emplearon tres cerdos hembra cuyas edades oscilaron entre los dos y seis meses. Dos fueron empleados para evaluar la infusión de mitocondrias y uno como control. En todos los animales se accedió bilateralmente a la arteria carótida; la arteria izquierda para la inyección de manitol con el objetivo de generar disrupción en la BHE; en la arteria contralateral no se inyectó manitol, de esta forma cada cerebro contó con su propio hemisferio control sin disrupción de la BHE. Esto permitió reducir al mínimo el número de animales requeridos para el presente estudio.

Aspectos éticos

Los animales fueron alimentados y mantenidos con libre acceso a agua hasta un día antes de la intervención. El manejo de los animales se realizó cumpliendo las Pautas Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica en Animales del Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS). El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética Institucional para el uso y manejo de animales de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (SIDISI 201478). Los animales fueron sedados empleando una inyección intramuscular de ketamina (10 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg). Se afeitaron los lugares de intervención seguido de lavado con jabón. Posteriormente, se procedió con la intubación endotraqueal de los animales y se mantuvieron sedados con dosis intravenosas de ketamina (5 mg/kg) cada 20 minutos. Todo el procedimiento quirúrgico cerebrovascular con microcatéteres se ejecutó en un ambiente estéril.

Colecta de biopsias de músculo esquelético

En los dos cerdos elegidos para la infusión de mitocondrias, la zona seleccionada para la toma de biopsias fue la pierna posterior. El área fue desinfectada con una solución de yodo povidona (10%) y se realizó una pequeña incisión con una hoja de bisturí n.^o11 (USA Medical, St. Louis, MO; EE. UU). Se colectaron tres muestras del músculo grácil por cada cerdo empleando un punzón para biopsias n.^o6 (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU). Se transportaron las muestras en tubos estériles de 50 mL con 20 mL de tampón fosfato salino (PBS pH 7,4) dentro de un contenedor con hielo. Finalmente se aplicó presión en la zona de la biopsia y se suturó.

Aislamiento y purificación de las mitocondrias

Se aislaron las mitocondrias en una cabina de flujo laminar, siguiendo el protocolo de Preble ¹⁸18. Preble JM, Pacak CA, Kondo H, MacKay AA, Cowan DB, McCully JD. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. JoVE. 2014; 91: e51682. doi: 10.3791/51682.
https://doi.org/10.3791/51682... . Se transfirió cada muestra a un tubo de 15 mL con 10 mL de tampón de homogeneización (sucrosa 300 mM; HEPES 10 mM; EDTA 1 mM; todos de la marca Sigma-Aldrich, ST. Louis, EE. UU) y se disgregó empleando un homogeneizador (Omni International, Kennesaw, GA, EE. UU) en 4 ciclos de 60 segundos. Luego se agregaron 250 µL de una solución de tripsina (4 mg de tripsina disueltos en 1 mL de tampón de homogeneización) y se incubó por 10 minutos en frío. Cada muestra se pasó a un nuevo tubo de 15 mL a través de un filtro celular de 40 µm (Falcon) humedecido con tampón de homogeneización frío. Luego se agregaron 250 µL de una solución de BSA (20 mg de BSA disueltos en 1 mL de tampón de homogeneización). Las muestras se pasaron por filtros de 40 y 10 µm humedecidos con tampón de homogeneización. Se centrifugaron a 9000 G (9000 × g) por 10 minutos a 4 °C, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en tampón de respiración (sucrosa 250 mM; KH₂PO₄ 2 mM; MgCl₂10 mM; HEPES 20 mM, EDTA 0,5 mM; todos de la marca Sigma-Aldrich, ST. Louis, EE. UU).

Viabilidad y marcado de mitocondrias

Se procedió a tomar una alícuota de 1 ml de la suspensión de mitocondrias y se incubó con MitoView Green (Biotium, Fremont, CA, EE. UU.) (200 nM) por 30 minutos para determinar el número total de mitocondrias obtenidas, luego se incubaron con Mitotracker Red CM-H₂Xros (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) (500 mM) por 30 minutos para determinar el número de mitocondrias viables. Se realizó el conteo utilizando un hemocitómetro y las imágenes fueron tomadas con microscopia confocal (Zeiss, LSM880, Oberkochen, Alemania). Se obtuvo el promedio y desviación estándar del conteo de mitocondrias totales y viables a partir de las tres muestras de músculo colectadas por cada cerdo. Antes de proceder con la infusión, el resto de las mitocondrias reconstituidas se incubaron con un anticuerpo monoclonal antimitocondria hecho en ratón (ABcam ab14730, Cambridge, Reino Unido) a una concentración de 1 µg/mL por 30 minutos a 4 °C.

Acceso vascular y disrupción de la barrera hematoencefálica

Empleando como referencia el manubrio del esternón y la asistencia por ultrasonido, se realizaron incisiones con una hoja de bisturí n.^o11 y se accedió bilateralmente a la arteria carótida. Se introdujo en la arteria izquierda una aguja ecogénica calibre 21 × 7 mm con guía de mandril de 0,018 × 40 cm del kit de microintroducción (Braun, Bethlehem, PA, EE. UU.) y se avanzó hasta observar un flujo pulsátil. Empleando la técnica de Seldinger ¹⁹19. Seldinger SI. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography; a new technique. Acta Radiol. 1953; 39: 368-376. doi: 10.3109/00016925309136722.
https://doi.org/10.3109/0001692530913672... , se reemplazó la aguja con un microcatéter con dilatador y, luego de una aspiración, se colocó una vía para goteo intraarterial de solución salina al 0,9%. Para proceder con la disrupción osmótica de la BHE ¹⁷17. Cosolo WC, Martinello P, Louis WJ, Christophidis N. Blood-brain barrier disruption using mannitol: time course and electron microscopy studies. Am J Physiol. 1989; 256: R443-R447. doi: 10.1152/ajpregu.1989.256.2.R443.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1989.256... se aplicó manitol a 0,25 mL/s por kg durante 20 segundos.

Infusión cerebral de mitocondrias autólogas por microcatéter

Luego de transcurridos cinco minutos de iniciada la disrupción osmótica de la BHE ²¹21. Bellavance MA, Blanchette M, Fortin D. Recent advances in bloodbrain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 2008; 10: 166-177. doi: 10.1208/s12248-008-9018-7.
https://doi.org/10.1208/s12248-008-9018-... , se retiró la vía con solución salina y se utilizó una jeringa estéril de 10 mL para administrar 5 mL de la resuspensión de mitocondrias marcadas seguido de 10 mL de tampón de respiración. Se retiró el microcatéter de la arteria carótida izquierda, se aplicó presión manual por 15 minutos y se suturaron tejidos profundos y superficiales. Este procedimiento se repitió con la sección contralateral, con la excepción de que no se realizó la disrupción osmótica de la BHE. En el caso del cerdo control, se infundió solo con tampón de respiración.

Inmunofluorescencia en biopsias de cerebro

Luego de 4 horas, los animales fueron sacrificados con una dosis letal de pentobarbital (120 mg/kg), se colectaron los tres cerebros, se analizó cada hemisferio por separado y se lo cortó en secciones de 10 mm. Las muestras fueron fijadas en formalina tamponada neutra al 10% por 24 horas, transferidas a etanol del 70% y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 4 µm y se colocaron en láminas portaobjetos tratadas con poli-L-lisina. Las secciones fueron desparafinadas a 56 °C, rehidratadas en una batería decreciente de alcoholes (100% a 70%) y permeabilizadas en buffer citrato (10 mM de ácido cítrico 0,05% de Tween 20, pH 6,0) a 95 °C por 30 minutos. Luego las secciones fueron incubadas por 30 minutos con solución de bloqueo (PBS pH 7,2; 0,05% de Tween 20; 0,1% de Triton X-100; 2% de suero de cabra; 2% de BSA) a temperatura ambiente en cámara húmeda, luego incubadas a 4 °C por toda la noche con un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluoresceína hecho en cabra (ABcam, Cambridge, Reino Unido) diluido 1/800 en PBS, lavadas tres veces por dos minutos con solución de lavado (PBS pH 7,2; 0,05% de Tween 20) y cubiertas con solución de montaje con DAPI (VectaShield, Vector, Laboratories, Burlingame, Ca, EE. UU.). Se tomaron las imágenes con microscopio confocal, con un objetivo de 10X (Zeiss, LSM880, Oberkochen, Alemania).

RESULTADOS DE LA APLICACIÓN DEL PROCEDIMIENTO

Viabilidad y cuantificación mitocondrial

La cuantificación de mitocondrias totales aisladas de tejido muscular empleando hemocitómetro y la señal verde producto de la tinción con Mitoview Green (Figura 1A) determinó una concentración total promedio de 1,05 × 10⁷± 7,20 × 10⁵ mitocondrias por mL. Sin embargo, la cuantificación basada en la señal roja del Mitotracker (Figura 1B), correspondiente a las mitocondrias con un potencial de membrana intacto, determinó una concentración aproximada del 63% de mitocondrias viables (6,61 × 10⁶± 9,90 × 10⁵ mitocondrias por mL).

Acceso arterial e infusión

Se realizó con éxito el acceso y microcateterización a las arterias carótidas, y se logró así la infusión de 5,24 × 10⁷± 3,59 × 10⁶ mitocondrias autólogas marcadas y reconstituidas en 5 mL de tampón de respiración. El tiempo del procedimiento, incluyendo la colecta de las muestras de músculo, acceso vascular, aislamiento e infusión mitocondrial en los dos cerdos experimentales fue de 48 y 42 minutos; 40 minutos aproximadamente dedicados al aislamiento, cuantificación y marcaje de las mitocondrias. El tiempo desde el inicio de la sedación hasta el retiro de tubos en los animales fue de aproximadamente 90 minutos. No se presentaron dificultades en la microcateterización, tampoco se presentaron otras complicaciones como inestabilidad hemodinámica, neumotórax, perforación vascular, accidentes cerebrovasculares o hematomas en las zonas de incisión.

Evaluaciones posinfusión

Muestras de diversas regiones corticales en cada uno de los cerebros se colectaron y evaluaron por triplicado mediante inmunofluorescencia. En la Figura 2 se muestran imágenes representativas de secciones del lóbulo frontal con y sin disrupción de la BHE. En ausencia de disrupción osmótica se observaron pocas mitocondrias marcadas y solo dentro del lumen de los capilares (Figura 2B-C). No se observaron cúmulos o áreas focales de agregación y fueron completamente ausentes en el parénquima cerebral. Luego de ocasionar la disrupción de la BHE, empleando una solución hiperosmótica de manitol, se observó una mayor concentración de mitocondrias marcadas en todas las regiones de la corteza y a través del parénquima en pequeños cúmulos de forma difusa y en patrones lineales (Figura 2D-F). La muestra control a la que se infundió solo tampón de respiración no dio señal con ni sin disrupción de la BHE (Figura 2G-I).

DISCUSIÓN

Este estudio constituye el primer reporte exitoso de infusión vía carótida de mitocondrias autólogas en el cerebro porcino, en el que se observa el ingreso de mitocondrias extracelulares al parénquima cerebral luego de alterar la permeabilidad de la BHE con manitol. En mamíferos sanos, el paso de iones, moléculas y células está limitado por la BHE, interfaz estructural y química entre el cerebro y el sistema circulatorio ¹⁵15. Hawkins BT, Davis TP. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 2005; 57: 173-185. doi: 10.1124/pr.57.2.4.
https://doi.org/10.1124/pr.57.2.4... . La permeabilidad de la BHE puede aumentar durante determinadas condiciones patológicas ¹⁵15. Hawkins BT, Davis TP. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 2005; 57: 173-185. doi: 10.1124/pr.57.2.4.
https://doi.org/10.1124/pr.57.2.4... ^,1616. Alroy KA, Arroyo G, Gilman RH, Gonzales-Gustavson E, Gallegos L, Gavidia CM, et al. Carotid Taenia solium Oncosphere Infection: A Novel Porcine Neurocysticercosis Model. Am J Trop Med Hyg. 2018; 99: 380-387. doi: 10.4269/ajtmh.17-0912.
https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0912... ^,2121. Bellavance MA, Blanchette M, Fortin D. Recent advances in bloodbrain barrier disruption as a CNS delivery strategy. AAPS J. 2008; 10: 166-177. doi: 10.1208/s12248-008-9018-7.
https://doi.org/10.1208/s12248-008-9018-... pero también puede modularse temporalmente con agentes osmóticos ¹⁹19. Seldinger SI. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography; a new technique. Acta Radiol. 1953; 39: 368-376. doi: 10.3109/00016925309136722.
https://doi.org/10.3109/0001692530913672... . Adicionalmente, se han establecido la dosis y el tiempo para la disrupción con manitol, y se han observado sus efectos temporales, por lo que se requiere de una apropiada sincronización entre disrupción de la BHE y la infusión de mitocondrias para aprovechar las alteraciones osmóticas.

Un desafío adicional en la adaptación de métodos experimentales con cerdos es su particular anatomía. Este procedimiento requiere un conocimiento detallado de las estructuras vasculares porcinas ²⁶26. Dondelinger RF, Ghysels MP, Brisbois D, Donkers E, Snaps FR, Saunders J, et al. Relevant radiological anatomy of the pig as a training model in interventional radiology. Eur Radiol. 1998; 8: 1254-1273. doi: 10.1007/s003300050545.
https://doi.org/10.1007/s003300050545... ^,2727. Kagetsu NJ, Berenstein A, Choi IS. Interventional radiology of the extracranial head and neck. Cardiovasc Intervent Radiol. 1991; 14: 325-333. doi: 10.1007/BF02577890.
https://doi.org/10.1007/BF02577890... para el posicionamiento cuidadoso del microcatéter y la técnica de infusión que permitan el ingreso de las mitocondrias infundidas al cerebro y no a tejidos extracraneales. La rete mirabile suele considerarse una barrera estructural adicional para los procedimientos cerebro vasculares porcinos (Figura 3), sin embargo, el diámetro de las microarterias de la rete mirabile oscilan entre los 50 y 250 µm ²⁸28. Massoud TF, Vinters HV, Chao KH, Viñuela F, Jahan R. Histopathologic characteristics of a chronic arteriovenous malformation in a swine model: preliminary study. AJNR Am J Neuroradiol. 2000; 21: 1268-1276. PMID: 10954279., lo que permite el paso de las mitocondrias cuyo diámetro es menor a 1 µm²⁹29. Miettinen TP, Björklund M. Mitochondrial Function and Cell Size: An Allometric Relationship. Trends Cell Biol. 2017; 27: 393-402. doi: 10.1016/j.tcb.2017.02.006.
https://doi.org/10.1016/j.tcb.2017.02.00... . Se ha demostrado el ingreso y localización en el cerebro de partículas de hasta 30 µm de tamaño después de la inyección vía carótida ¹⁶16. Alroy KA, Arroyo G, Gilman RH, Gonzales-Gustavson E, Gallegos L, Gavidia CM, et al. Carotid Taenia solium Oncosphere Infection: A Novel Porcine Neurocysticercosis Model. Am J Trop Med Hyg. 2018; 99: 380-387. doi: 10.4269/ajtmh.17-0912.
https://doi.org/10.4269/ajtmh.17-0912... , lo que sugiere que el paso más allá de la rete es posible. Dada la extensa red colateral, es posible que algunas mitocondrias infundidas se hayan desviado a otros tejidos, sin embargo, nosotros nos centramos en evaluar su ingreso al cerebro y no evaluamos otros tejidos.

Empleando metodologías validadas¹1. McCully JD, Cowan DB, Emani SM, Del Nido PJ. Mitochondrial transplantation: From animal models to clinical use in humans. Mitochondrion. 2017; 34: 127-34. doi: 10.1016/j.mito.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.03.0... ^,33. Shin B, Saeed MY, Esch JJ, Guariento A, Blitzer D, Moskowitzova K, et al. A Novel Biological Strategy for Myocardial Protection by Intracoronary Delivery of Mitochondria: Safety and Efficacy. JACC Basic Transl Sci. 2019; 4: 871-888. doi: 10.1016/j.jacbts.2019.08.007.
https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2019.08... ^,1717. Cosolo WC, Martinello P, Louis WJ, Christophidis N. Blood-brain barrier disruption using mannitol: time course and electron microscopy studies. Am J Physiol. 1989; 256: R443-R447. doi: 10.1152/ajpregu.1989.256.2.R443.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1989.256... ^,2222. Rasmussen HN, Andersen AJ, Rasmussen UF. Optimization of preparation of mitochondria from 25-100 mg skeletal muscle. Anal Biochem. 1997; 252: 153-9. doi: 10.1006/abio.1997.2304.
https://doi.org/10.1006/abio.1997.2304... y técnicas estándares de administración arteriográfica cerebrovascular¹⁸18. Preble JM, Pacak CA, Kondo H, MacKay AA, Cowan DB, McCully JD. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. JoVE. 2014; 91: e51682. doi: 10.3791/51682.
https://doi.org/10.3791/51682... ^,2323. Blanc R, Piotin M, Mounayer C, Spelle L, Moret J. Direct cervical arterial access for intracranial endovascular treatment. Neuroradiology. 2006; 48: 925-929. doi: 10.1007/s00234-006-0157-1.
https://doi.org/10.1007/s00234-006-0157-... ^,2424. Dorfer C, Standhardt H, Gruber A, Ferraz-Leite H, Knosp E, Bavinzski G. Direct percutaneous puncture approach versus surgical cutdown technique for intracranial neuroendovascular procedures: technical aspects. World Neurosurg. 2012; 77: 192-200. doi: 10.1016/j.wneu.2010.11.007.
https://doi.org/10.1016/j.wneu.2010.11.0... , el procedimiento pudo completarse en 45 minutos aproximadamente. Por otra parte, no se ha establecido una dosis de mitocondrias para el cerebro, pero en estudios de isquemia cardiaca determinan una dosis adecuada de 1 × 10⁹mitocondrias ³3. Shin B, Saeed MY, Esch JJ, Guariento A, Blitzer D, Moskowitzova K, et al. A Novel Biological Strategy for Myocardial Protection by Intracoronary Delivery of Mitochondria: Safety and Efficacy. JACC Basic Transl Sci. 2019; 4: 871-888. doi: 10.1016/j.jacbts.2019.08.007.
https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2019.08... ^,11. McCully JD, Cowan DB, Emani SM, Del Nido PJ. Mitochondrial transplantation: From animal models to clinical use in humans. Mitochondrion. 2017; 34: 127-34. doi: 10.1016/j.mito.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.03.0... . Los estudios cardiacos se encuentran más avanzados y solo existen modelos murinos de infusión cerebral. En todos los estudios publicados, en los que se ha empleado el modelo murino, varían las dosis y los métodos de infusión. En esta evaluación, empleamos el rendimiento obtenido con 0,1 g de músculo esquelético y un número máximo de 1 × 10⁹mitocondrias. Sin embargo, considerando la técnica de administración vascular, el flujo sanguíneo cerebral en el cerdo, el volumen de sangre en el cerebro ³⁰30. Sakoh M, Røhl L, Gyldensted C, Gjedde A, Ostergaard L. Cerebral blood flow and blood volume measured by magnetic resonance imaging bolus tracking after acute stroke in pigs: comparison with [(15)O] H(2)O positron emission tomography. Stroke. 2000; 31: 1958-64. doi: 10.1161/01.str.31.8.1958.
https://doi.org/10.1161/01.str.31.8.1958... y la posible desviación por la anatomía de la rete mirabile de la arteria carótida en los cerdos ²⁶26. Dondelinger RF, Ghysels MP, Brisbois D, Donkers E, Snaps FR, Saunders J, et al. Relevant radiological anatomy of the pig as a training model in interventional radiology. Eur Radiol. 1998; 8: 1254-1273. doi: 10.1007/s003300050545.
https://doi.org/10.1007/s003300050545... , la dosis establecida para la infusión de mitocondrias fue de 5 × 10⁷. Las muestras permitieron obtener un total de 1,1 × 10⁷- 2,4 × 10¹⁰ mitocondrias, asegurando la cuantificación y la administración en la dosis establecida. Nuestros hallazgos en el rendimiento y la viabilidad de las mitocondrias aisladas de tejido muscular esquelético concuerdan con experimentos realizados en otros animales ¹1. McCully JD, Cowan DB, Emani SM, Del Nido PJ. Mitochondrial transplantation: From animal models to clinical use in humans. Mitochondrion. 2017; 34: 127-34. doi: 10.1016/j.mito.2017.03.004.
https://doi.org/10.1016/j.mito.2017.03.0... ^,33. Shin B, Saeed MY, Esch JJ, Guariento A, Blitzer D, Moskowitzova K, et al. A Novel Biological Strategy for Myocardial Protection by Intracoronary Delivery of Mitochondria: Safety and Efficacy. JACC Basic Transl Sci. 2019; 4: 871-888. doi: 10.1016/j.jacbts.2019.08.007.
https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2019.08... ^,1717. Cosolo WC, Martinello P, Louis WJ, Christophidis N. Blood-brain barrier disruption using mannitol: time course and electron microscopy studies. Am J Physiol. 1989; 256: R443-R447. doi: 10.1152/ajpregu.1989.256.2.R443.
https://doi.org/10.1152/ajpregu.1989.256... ^,2222. Rasmussen HN, Andersen AJ, Rasmussen UF. Optimization of preparation of mitochondria from 25-100 mg skeletal muscle. Anal Biochem. 1997; 252: 153-9. doi: 10.1006/abio.1997.2304.
https://doi.org/10.1006/abio.1997.2304... ^,2525. Frezza C, Cipolat S, Scorrano L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle, and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2007; 2: 287-295. doi: 10.1038/nprot.2006.478.
https://doi.org/10.1038/nprot.2006.478... y seres humanos ²2. Emani SM, Piekarski BL, Harrild D, Del Nido PJ, McCully JD. Autologous mitochondrial transplantation for dysfunction after ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 2017; 154: 286-289. doi: 10.1016/j. jtcvs.2017.02.018.
https://doi.org/10.1016/j... .

Inicialmente, consideramos la coinfusión del colorante vital azul de Evans para lograr una fácil interpretación macroscópica de la permeabilidad de la BHE, sin embargo, al no haberse realizado estudios que confirmen si existe o no una toxicidad directa sobre las mitocondrias aisladas al emplear este colorante ²⁰20. Saunders NR, Dziegielewska KM, Møllgård K, Habgood MD. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives?. Front Neurosci. 2015; 385: 1-16. doi: 10.3389/fnins.2015.00385.
https://doi.org/10.3389/fnins.2015.00385... , decidimos no incluirlo.

En conclusión, en este trabajo experimental se detallan los procedimientos empleados para el aislamiento e infusión de mitocondrias autólogas en el cerebro porcino de una forma segura utilizando equipos estándares y protocolos validados. Este estudio demuestra el ingreso de mitocondrias en el tejido cerebral luego de la infusión vía carótida en cerdos cuya BHE ha sido alterada osmóticamente. Se requieren mayores estudios para determinar la distribución específica de las mitocondrias infundidas y los mecanismos involucrados en la internalización de mitocondrias autólogas en los diversos tipos de células nerviosas (neuronas o glías).

El potencial beneficio de la infusión de mitocondrias puede aplicarse a todo un espectro de enfermedades neurológicas y la inyección vía carótida en un modelo porcino constituye una herramienta útil para su evaluación.

Agradecimientos:

Los autores desean agradecer a los doctores Juan F. Calcina, Ana Vargas Calla y Elton Sánchez por su experiencia y apoyo. Al Dr. James McCully por su asesoría, Al Dr. Yashar Kalani por las sugerencias experimentales, a Emma Vought por la ilustración de la vasculatura cerebral porcina y a Kris Oshiro por su apoyo en la redacción de los protocolos de buenas prácticas para la infusión de mitocondrias empleando microcatéteres.

Referencias bibliográficas

Fechas de Publicación

Histórico